齊香君, 徐婷婷
(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)
本實(shí)驗(yàn)室為尋找高效的油脂降解菌,從餐廳油煙排出口附近篩選出一株油脂降解菌QZX-A,經(jīng)鑒定該菌株為銅綠假單胞菌.在對QZX-A菌株研究的過程中,涉及到定量測定鼠李糖脂的量[1].目前定量測定鼠李糖脂方法不一,且即使采用同一測定方法但最大吸收波長不一,推測可能是發(fā)酵液中的其他不明成分對測定鼠李糖脂造成了干擾.針對這一現(xiàn)狀,為了準(zhǔn)確測定發(fā)酵液中的鼠李糖脂,本研究采用蒽酮硫酸法定量測定發(fā)酵液中的鼠李糖脂[2],系統(tǒng)地研究了反應(yīng)條件,并做了方法學(xué)考察.與其他蒽酮硫酸法不同的是,本研究在測定發(fā)酵液中的鼠李糖脂時(shí)采用的空白對照是未接種的發(fā)酵液,除了沒有接種,其他成分都與發(fā)酵液嚴(yán)格一致.
760CRT雙光束紫外可見分光光度計(jì),752型紫外分光光度計(jì),F(xiàn)A2004上皿電子天平.
1.2.1 發(fā)酵液的制備
取銅綠假單胞菌QZX-B培養(yǎng)3 d的發(fā)酵液(培養(yǎng)基成分:KH2PO40.05%,K2HPO40.05%,(NH4)2SO40.1%,MgSO4·7H2O 0.01%,菜籽油1%,pH 8;培養(yǎng)條件:30 ℃,130 r/min,3 d).
1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制
稱取干燥恒重的鼠李糖對照品8.6 mg,用水溶解,定容于100 mL量瓶中,配制成0.086 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.
1.2.3 蒽酮試劑的配制
取蒽酮0.20 g溶于100 mL 85%的硫酸中.
1.2.4 測定方法[3]
精確取標(biāo)準(zhǔn)品溶液或發(fā)酵液1.0 mL置于試管中,于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL,加完后混合均勻浸于沸水浴中, 15 min后取出,用自來水冷卻,室溫放置20 min.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的空白以蒸餾水代替鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品,發(fā)酵液的空白對照以未接種的培養(yǎng)基代替發(fā)酵液,進(jìn)行紫外檢測或者掃描.
采用1.2.4中測定方法,研究該方法中的最大吸收波長、水解時(shí)間、水解溫度、蒽酮試劑加量、發(fā)酵液稀釋倍數(shù)等內(nèi)容.
采用2.1的研究結(jié)果,考察該方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率.
3.1.1 驗(yàn)證鼠李糖脂的存在
比較圖1和圖2可以明顯看出,圖2在620 nm處的特征峰高度在原有基礎(chǔ)上增加,峰形未發(fā)生變化,位置未發(fā)生偏移,因此可以確定發(fā)酵液中存在鼠李糖脂,且可以用測定鼠李糖的方法對鼠李糖脂定量檢測.
圖1 發(fā)酵液全波長掃描圖 圖2 發(fā)酵液添加鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品后的全波長掃描圖
3.1.2最大吸收波長選擇
由圖3和圖4可知,標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵液的共有特征吸收峰在620 nm處重合,所以取620 nm為最大吸收波長.圖4采用未接種的發(fā)酵液作為空白對照,除了沒有接種,其他成分都與發(fā)酵液嚴(yán)格一致.
圖3 鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品波長掃描圖 圖4 發(fā)酵液波長掃描圖
表1 不同水解時(shí)間的吸光度值(n=3),反應(yīng)溫度100 ℃
3.1.3 水解時(shí)間的選擇
由表1可以看出,水解15 min的吸光度值最大,說明鼠李糖脂此時(shí)水解程度最高,因此選15 min為最適水解時(shí)間.時(shí)間多于15 min溶液顏色由藍(lán)綠色變?yōu)樽丶t色,可能是水解時(shí)間過長,使發(fā)酵液中的其他成分發(fā)生了變化,影響顯色,導(dǎo)致數(shù)據(jù)不穩(wěn)定.
表2 不同水解溫度下的吸光度值(n=3),水解15 min
3.1.4 水解溫度的選擇
由表2可知,水解溫度在80~100 ℃時(shí)吸光度值趨于穩(wěn)定,100 ℃時(shí)吸光度值最大,因此選取100 ℃為最適水解溫度.
3.1.5 蒽酮試劑加入量的選擇
蒽酮試劑加入量為1 mL,2 mL,3 mL時(shí),因?yàn)榱蛩岜幌♂?,蒽酮析出,溶液渾濁?dǎo)致無法測量.加入量大于4 mL時(shí),顏色偏黃棕色,可能是硫酸濃度過高,導(dǎo)致發(fā)酵液中其他成分碳化,影響檢測.經(jīng)紫外掃描,發(fā)現(xiàn)蒽酮加入量大于4 mL時(shí),620 nm附近無特征吸收峰.因此選4 mL為最適加入量.
表3 不同蒽酮試劑加入量下的吸光度(n=3),水解時(shí)間15 min,反應(yīng)溫度100 ℃
3.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[4]
圖5 鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL于10 mL容量瓶中,加蒸餾水定溶搖勻,再分別吸取各濃度鼠李糖溶液1 mL,加人4 mL蒽酮試液,于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL,加完后混合均勻浸于沸水浴中,自水浴重新煮沸起15 min后取出,用自來水冷卻,室溫放置20 min后以蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液做對照,于620 nm處測定.
以鼠李糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),做回歸處理[5],得回歸方程為y= 0.006x+0.003 3,相關(guān)系數(shù)R=0. 999 2,鼠李糖在濃度為8.6~60.2 mg/L范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系.
3.1.7 發(fā)酵液樣品中鼠李糖含量的測定
精密吸取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液1 mL,于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL,加完后混合均勻浸于沸水浴中,自水浴重新煮沸起15 min后取出,用自來水冷卻,室溫放置20 min后以未接種的發(fā)酵液做空白對照,于620 nm處測定.
表4 穩(wěn)定性測定數(shù)據(jù)(n=3)
該批發(fā)酵液鼠李糖脂的產(chǎn)量為1 057.75 mg/L.
3.2.1 穩(wěn)定性
取同一瓶樣品溶液,按3.1.8方法操作,放置顯色后每隔30 min測定1次,共測定5次,結(jié)果見表4,符合要求.
表5 重復(fù)性測定數(shù)據(jù)(n=3)
3.2.2 重復(fù)性
取同一批發(fā)酵液共5瓶,每瓶分別取樣稀釋,按3.1.8方法操作,測定其吸光度值,結(jié)果見表5,符合要求.
3.2.3 回收率試驗(yàn)
表6 回收率測定數(shù)據(jù)(n=3)
取已知濃度的樣品溶液5份,分別加入一定量的鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液,測定吸光度值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成鼠李糖的濃度,計(jì)算回收率,結(jié)果見表6.
加標(biāo)回收率達(dá)到99.98%,RSD=2.2%(n=5),符合要求.
3.2.4 精密度
取同一瓶樣品溶液,按3.1.8方法操作,重復(fù)測定5次,結(jié)果見表7.RSD=0.1%,精密度符合要求.
(1)蒽酮硫酸法測定發(fā)酵液中鼠李糖脂的條件為:精密吸取稀釋4倍的發(fā)酵液1 mL,于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL,加完后混合均勻浸于沸水浴中,自水浴重新煮沸起15 min后取出,用自來水冷卻,室溫放置20 min后以未接種的發(fā)酵液代替接種后的發(fā)酵液做空白對照,于620 nm處測定.
蒽酮硫酸法測發(fā)酵液中的鼠李糖脂,反應(yīng)條件與蒽酮硫酸法測糖的反應(yīng)條件相同.本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于采用未接種的空白培養(yǎng)基代替待測樣品中的發(fā)酵液作為空白,而不是采用蒸餾水做空白,優(yōu)點(diǎn)在于能夠消除其他物質(zhì)的干擾.
表7 精密度測定數(shù)據(jù)(n=3)
(2)方法學(xué)考察穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率、精密度合格.
(3)按照該方法測定發(fā)酵液中鼠李糖脂的量,得到的結(jié)果為1 057.75 mg/L.
因此采用本方法測定發(fā)酵液中鼠李糖脂,方法可靠可行.
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