基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀*

周亞濱，王 巖

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

從基因概念的提出到人類基因組學(xué)計(jì)劃（HGP）的完成，半個世紀(jì)以來，有關(guān)基因的研究得到飛速發(fā)展。基因芯片技術(shù)是基因功能研究中最偉大的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)，它融合了生命科學(xué)、化學(xué)、微電子學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)等諸多學(xué)科領(lǐng)域的成就，具有高通量、簡便、微縮、集約化、平行化等優(yōu)點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)的精髓為整體觀念和辨證論治理論，且中藥具有作用多靶點(diǎn)等優(yōu)勢，這些優(yōu)勢同時也阻礙中醫(yī)藥科研的發(fā)展，但是隨著基因芯片技術(shù)的日益成熟，可以在同一實(shí)驗(yàn)條件下，一次性檢驗(yàn)上萬個生物信息的改變，為中醫(yī)藥客觀化、定量化、標(biāo)準(zhǔn)化研究提供了便利。目前，基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用主要有：中醫(yī)證候、中藥新藥研究包括中藥藥效及藥理學(xué)研究、中藥有效成分篩選研究、中藥毒副作用研究等方面。

1 中醫(yī)證候研究

幾千年來，中醫(yī)藥作為防治疾病的主要武器，為保障中國人民的健康起著不可忽視的作用。辨證論治為中醫(yī)學(xué)的主要特色之一，“論治”的前提是“辨證”，何為“證”呢？所謂“證”是指證候，是從若干復(fù)雜癥狀（包括脈象、舌苔等）中，經(jīng)過分析、綜合、歸納而得出的證據(jù)[1]。根據(jù)不同的證，推斷出疾病的病因、病性、病位，再采用不同的方法進(jìn)行治療，但是由于疾病的復(fù)雜性，同病異治、異病同治等使辨證論治具有很大的靈活性，很難將其客觀化、微觀化，阻礙了中醫(yī)學(xué)的發(fā)展。然而隨著基因芯片技術(shù)的日益成熟，運(yùn)用大規(guī)模、高通量的基因芯片技術(shù)，對足夠數(shù)量的同一證型患者的基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，建立辨證要素的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，再相互組合便可建立證型基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，以此可作為辨證的客觀規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，因此基因芯片技術(shù)片為中醫(yī)的客觀化、微觀化研究提供了思路與方法，有望成為中醫(yī)現(xiàn)代化的有效手段[2]。

王明臣等用基因芯片技術(shù)檢測腎陽虛證骨關(guān)節(jié)炎患者及正常人的基因表達(dá)譜，篩選出與腎陽虛骨關(guān)節(jié)炎免疫相關(guān)的基因13條，腎陽虛骨關(guān)節(jié)炎患者與正常人相比表達(dá)下調(diào)4 條，上調(diào) 5 條[3]。

王米渠等[4]對寒證基因芯片的檢測數(shù)據(jù)提出了分析方法：1）縱向發(fā)展的聚類分析（個體用藥后的連續(xù)追蹤，進(jìn)而研究家系寒證）。2）橫向互比的聚類分析（利用樹狀分層圖等分析有關(guān)證候的調(diào)查數(shù)據(jù)）。3）分證候的聚類分析（如肢冷單個證候的療效分析）。4）合寒證聚類分析（研究寒證證候變異主因素及其主效基因組之關(guān)系）。羅云堅(jiān)等[5]用4張基因芯片探討脾氣虛證免疫相關(guān)基因組學(xué)機(jī)制，選擇脾氣虛證慢性胃炎和潰瘍性結(jié)腸炎病例及正常人各3例，分別采集其外周血，提取白細(xì)胞RNA行基因芯片檢測，結(jié)果慢性胃炎脾氣虛證和潰瘍性結(jié)腸炎脾氣虛證異常表達(dá)的免疫相關(guān)基因分別為68條和57條，兩者相同的差異表達(dá)基因?yàn)?條，主要是與免疫相關(guān)的基因。提示脾氣虛證發(fā)生有其免疫相關(guān)基因組學(xué)基礎(chǔ)，是細(xì)胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫功能等方面發(fā)生功能紊亂。陳曉玲等[6]對一個典型的腎陽虛家系15個成員,以寡核苷酸雜交技術(shù)對其外周血單核細(xì)胞的差異表達(dá)譜分析研究,結(jié)果:1）典型腎陽虛證/正常對照組:上調(diào)基因100條,下調(diào)基因33條。2）腎陽虛證/正常對照組:上調(diào)基因148條,下調(diào)基因31條。3）典型腎陽虛證治療顯效者治療前/治療后:上調(diào)基因12條,下調(diào)基因47條。4）典型腎陽虛證/正常配偶:上調(diào)基因66條,下調(diào)基因44條。這些基因主要為:物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝和免疫調(diào)節(jié)等,初步反映出腎陽虛證患者惡寒喜暖、肢冷倦臥、面色淡白等宏觀證候在微觀基因表達(dá)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

2 中藥新藥研究

2.1 中藥藥理學(xué)研究 由于中藥成分非常復(fù)雜，單純應(yīng)用傳統(tǒng)的藥物研究方法，很難從整體上其對進(jìn)行研究。通過基因芯片在同一實(shí)驗(yàn)條件下，一次性檢驗(yàn)上萬個生物信息的改變，為多靶點(diǎn)藥物作用機(jī)制的研究提供了有效的工具。

楊柳等[7]利用基因芯片技術(shù)分析杞菊地黃湯防治N-甲基-N亞硝酸脲（MNU）誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜變性的視網(wǎng)膜基因表達(dá)譜變化,結(jié)果表明,模型組/正常組和模型組/藥物組中分別有75個和118個差異表達(dá)基因,這些基因多與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育、免疫和防御、凋亡等生物過程有關(guān),主要涉及到絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Toll樣受體和凋亡信號通路。因此證明,杞菊地黃湯通過預(yù)防MNU促凋亡作用來發(fā)揮其抗視網(wǎng)膜損害的藥理學(xué)效應(yīng)。黃建等[8]采用基因芯片檢測苦參堿處理后細(xì)胞基因表達(dá)改變情況。在22216個基因中,0.5 g/L苦參堿組表達(dá)上升或下調(diào)的基因占總基因數(shù)的8.01%,1.0 g/L苦參堿組占總數(shù)的10.04%,兩組表達(dá)均顯著增加的有98個基因,減少的有80個,主要與增殖、細(xì)胞周期、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、代謝等相關(guān)。陳立軍等[9]利用基因芯片檢測青蒿琥酯作用于K562細(xì)胞后的基因表達(dá)情況，分析數(shù)據(jù)顯示10條基因表達(dá)有差異,p 21、chk1表達(dá)上調(diào),細(xì)胞周期素（cyclin）B1、cyclinE1、轉(zhuǎn)錄因子（E2F1）、DNA 2PK、端粒酶逆轉(zhuǎn)因子（hTERT）、bcl22、jnk、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)下調(diào)，由此可見青蒿琥酯可以抑制K562細(xì)胞增殖,作用機(jī)制與改變細(xì)胞周期某些調(diào)控物質(zhì)的基因表達(dá)、誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡有關(guān)。趙建學(xué)等[10]利用基因芯片探討雙虎清肝顆粒對四氯化碳誘發(fā)大鼠肝損傷模型肝組織基因表達(dá)譜的影響。四氯化碳作用于大鼠后，與未皮下注射四氯化碳的大鼠比較，大鼠肝組織的鈣離子相關(guān)基因、細(xì)胞黏附、細(xì)胞連接和膠原形成的基因的表達(dá)均有上調(diào)的趨勢，雙虎清肝顆粒干預(yù)后C1、C2、C3、D組與B組比較,CY相關(guān)基因、蛋白質(zhì)糖基化相關(guān)基因、脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)均上調(diào)；雙虎清肝顆粒干預(yù)前后C1、C2、C3組間比較，干預(yù)前上調(diào)者干預(yù)后下調(diào)明顯，干預(yù)前下調(diào)者干預(yù)后上調(diào)明顯，且隨著雙虎清肝顆粒劑量的增加，基因表達(dá)的幅度也增加。

2.2 中藥有效成份篩選研究 國外學(xué)者對黃連的抗腫瘤增殖活性的有效部位進(jìn)行了篩選,使用了含有12600個基因的DNAmicroarray而檢驗(yàn)了黃連及8個組分的抗增殖效應(yīng),發(fā)現(xiàn)27個基因和黃連的ID50相關(guān),其中黃連素是主要的抗增殖活性成分[11]。據(jù)報(bào)道，香港科技大學(xué)生物技術(shù)研究所利用基因芯片技術(shù)已篩選到知母的23種有效成分，如果再從cDNA表達(dá)文庫中得到的肽庫制作肽芯片，則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質(zhì)[12]。

2.3 中藥毒副作用研究 中藥主要是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的整體功能，即通過對基因的表達(dá)調(diào)控而起作用的。利用基因表達(dá)譜芯片對比研究某種中藥或其提取物作用于動物前后特定細(xì)胞中相關(guān)功能基因表達(dá)mRNA水平的異常變化，可提示該中藥在研究劑量下是否有細(xì)胞毒性及產(chǎn)生毒性作用的機(jī)制[13]。毒理學(xué)研究的芯片稱作“Toxchip”或“Toxblot”，包含了可能受毒性物質(zhì)影響的上千個基因，所涉及的基因包括凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、藥物轉(zhuǎn)化和代謝、DNA復(fù)制及修復(fù)、熱休克、氧化應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)基因，這些基因排列在載玻片大小的塑料或玻璃板上，從動物或暴露于藥物的培養(yǎng)組織中提取的相匹配遺傳物質(zhì)與芯片上探針雜交，從而進(jìn)行中藥的安全性評價[15]。Kiela 等[15]報(bào)道,在研究印度乳香（Boswellia serrata）的提取物時發(fā)現(xiàn)，給予高劑量該藥后不能改善腸炎的癥狀，在進(jìn)行肝臟基因的表達(dá)譜分析時發(fā)現(xiàn)該藥高劑量組中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的大量基因表達(dá)失調(diào)，表明高劑量給藥時該藥具有肝毒性。

綜上所述基因芯片技術(shù)可廣泛應(yīng)用于中醫(yī)證候的基礎(chǔ)研究、中藥藥理學(xué)、中藥有效成分篩選、中藥毒理學(xué)等研究領(lǐng)域，為基因組學(xué)與中醫(yī)藥學(xué)研究架起了一座橋梁，對于揭示中醫(yī)藥的深刻內(nèi)涵，推動中醫(yī)藥走向世界具有重要的意義。同時基因芯片技術(shù)仍然存在費(fèi)用高昂，技術(shù)復(fù)雜，特異性低等缺點(diǎn)，但相信隨著基因芯片制作及雜交條件的不斷升級，這些問題最終都會迎刃而解的，其在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。

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