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      棗花蜜中清除DPPH自由基的活性成分

      2010-03-21 07:24:16穆雪峰孫麗萍
      食品科學(xué) 2010年21期
      關(guān)鍵詞:山奈柚皮素甲醇溶液

      穆雪峰,孫麗萍*,徐 響,龐 杰

      棗花蜜中清除DPPH自由基的活性成分

      穆雪峰1,2,孫麗萍1,*,徐 響1,龐 杰2

      (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京 100093;2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

      通過HPLC-DPPH和清除DPPH自由基實驗研究棗花蜜中對DPPH自由基具有清除作用的活性成分,并測定已知活性成分的含量。結(jié)果表明:棗花蜜中存在12種對DPPH自由基有清除作用的活性成分,其中4種是已知化合物——咖啡酸、對香豆酸、山奈酚和柚皮素,其含量在48.8~741.3μg/100g,各成分對DPPH自由基的清除能力存在明顯差異,其差異與分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

      棗花蜜;活性成分;DPPH自由基;分子結(jié)構(gòu)

      棗樹(Ziziphus jujuba Mill.)為鼠李科落葉喬木或灌木,原產(chǎn)我國,世界有100多種,我國有十幾種,皆為蜜源植物。棗花蜜為我國眾多大宗商品蜂蜜中的一種,有特殊的棗花香味,味甜,不易結(jié)晶等特點。棗花蜜主要產(chǎn)于我國山東、河南、河北等省。蜂蜜是藥食兼用的天然綠色食品,含有黃酮類、酚酸、抗壞血酸、類胡蘿卜素及過氧化物酶等多種生物活性成分[1-3],具有抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、抗癌、清除自由基、消炎抑菌、預(yù)防心腦血管疾病等生理及保健功能[4]。

      國內(nèi)外對棗花蜜抗氧化活性研究不少,大部分研究集中在棗花蜜提取物對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、脂質(zhì)過氧化自由基和人體血清脂蛋白氧化修飾等的清除作用[5-7]。有關(guān)棗花蜜中抗氧化活性成分的研究尚未見報道。本實驗采用HPLC-DPPH和清除DPPH自由基實驗,研究棗花蜜中對DPPH自由基具有清除能力的活性成分,對其中的已知化合物進行含量測定,分析構(gòu)效關(guān)系,為揭示蜂蜜抗氧化功能的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料、試劑與儀器

      棗花蜜產(chǎn)自北京懷柔,由北京君健生蜂產(chǎn)品有限公司提供。

      AB-8大孔樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司;Sephadex LH-20、DPPH、咖啡酸、對香豆酸、柚皮素、山奈酚 美國Sigma公司;甲醇(色譜純) Fisher公司;其他試劑均為分析純。

      AL204電子天平 梅特勒-托利多(上海)公司;LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司;Synergy HT酶標(biāo)儀 BioTek基因有限公司;HL-2B數(shù)顯恒流泵 上海

      精科實業(yè)有限公司。

      1.2 方法

      1.2.1 樣品制備

      取棗花蜜170g,去離子水(1:6,m/V)溶解后上AB-8大孔樹脂柱,40%~95%乙醇梯度洗脫,洗脫液脫醇后乙酸乙酯萃取,減壓濃縮至干,記為樣品B。用少量甲醇溶解樣品B,樣采用Sephadex LH-20柱,用25%~80%乙醇梯度洗脫,洗脫液脫醇后乙酸乙酯萃取,減壓濃縮至干,記為樣品C。

      1.2.2 HPLC-DPPH實驗

      取一定質(zhì)量濃度的樣品B甲醇溶液100μL,加100μL 1.8mg/mL的DPPH甲醇溶液,作為實驗組,避光反應(yīng)1h;取一定質(zhì)量濃度的樣品B甲醇溶液100μL,加100μL甲醇,作為空白組。液相條件參考Letcia等[8]方法并稍作改變。色譜柱:Sham-Pack VP-ODS(150mm×4.6mm);流動相:甲醇-甲酸水(水含有磷酸體積分數(shù)為0.2%):甲醇體積分數(shù)為:0~10min,5%~17%;10~20min,17%~26%;20~40min,26%~58%;40~50min,58%~95%;50~60min,95%~5%。流速:1.0mL/min;溫度40℃;各進樣20μL,檢測波長為320nm。清除率計算如公式(1)。

      式中:S1為空白組對應(yīng)吸收峰的峰面積;S2為實驗組對應(yīng)吸收峰的峰面積。

      1.2.3 清除DPPH自由基實驗

      參考楊佳林等[9]的方法略有改動。向96孔板中加入100μL不同質(zhì)量濃度的咖啡酸、對香豆酸、柚皮素、山奈酚甲醇溶液,再分別加入100μL 0.13mg/mL DPPH甲醇溶液,混合均勻,室溫下避光反應(yīng)35min,于517nm波長處測定吸光度,記為A1;同時以100μL DPPH溶液與100μL甲醇溶液混合后的吸光度記為A2;以100μL甲醇與100μL咖啡酸、對香豆酸、柚皮素、山奈酚溶液混合后的吸光度記為A0。平行測定3次,分別以試樣質(zhì)量濃度和清除率進行線性回歸并計算IC50。清除率計算如公式(2)。

      1.2.4 已知化合物含量測定

      將質(zhì)量濃度為144μg/mL的咖啡酸、對香豆酸、柚皮素、山奈酚混合標(biāo)準(zhǔn)液,用甲醇等比稀釋后進行HPLC分析。液相方法同1.2.2節(jié),進樣20μL,平行測定3次。以混合標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度與峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 進行線性回歸;同時取樣品C甲醇溶液進樣20μL,根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程計算已知化合物含量。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 DPPH自由基清除活性

      DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基,其甲醇溶液呈紫色,在波長517nm處有最大吸收。當(dāng)有抗氧化劑存在時,生成DPPH-H分子,溶液的紫色向黃色變化,吸光度變小,而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈定量關(guān)系,通過測定樣品對DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的強弱[10-11]。

      HPLC-DPPH是一種將HPLC和抗氧化活性測定相結(jié)合的方法,向含有抗氧化成分的甲醇溶液中加入DPPH甲醇溶液,用HPLC分析充分反應(yīng)后的混合溶液,根據(jù)樣品在添加DPPH溶液前后峰面積下降的程度評價活性成分的抗氧化能力[11]。若樣品中存在對DPPH具有清除作用的抗氧化成分,該成分在色譜圖中對應(yīng)的吸收峰會下降或消失。采用HPLC-DPPH實驗,向樣品B甲醇溶液加入DPPH甲醇溶液后進行液相分析,根據(jù)空白組和實驗組對應(yīng)吸收峰面積的變化,計算棗花蜜中活性成分對DPPH自由基的清除率,結(jié)果見表1。

      表1 棗花蜜中對DPPH自由基具有清除作用的活性成分Table 1 Bioactive components scavenging DPPH free radicals found in date honey

      由表1可知,棗花蜜中存在12種對DPPH自由基有清除作用的活性成分。根據(jù)反應(yīng)前后峰面積變化可知,保留時間為5.98、12.97、18.98min吸收峰消失,表明1#、2#和4#成分對DPPH自由基具有極強的清除作用;保留時間為13.66、37.48、43.07、51.99min吸收峰峰面積明顯下降,表明3#、9#、11#和12#成分具有很強的清除DPPH自由基的能力,經(jīng)計算,其清除率在84%以上;保留時間為25.74、26.75、34.58、39.73min的吸收峰反應(yīng)前后面積變化較小,說明6#、7#、8#和

      10#成分清除DPPH自由基的能力較弱,清除率在16%~33%之間;而保留時間為24.65min的5#成分清除率僅為2.15%,表明5#成分對DPPH自由基的清除能力極弱。由此可見,棗花蜜中不同活性成分對DPPH自由基清除能力強弱不同,可能與其含量和分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。

      圖1 4種活性成分的液相色譜和紫外圖譜Fig.1 HPLC chromatograms and UV spectra of four identified bioactive components

      通過樣品B甲醇溶液與標(biāo)準(zhǔn)品的液相圖譜和紫外圖譜對照發(fā)現(xiàn)(圖1),4#、5#、10#和11#活性成分分別為咖啡酸、對香豆酸、柚皮素和山奈酚,其余8種活性成分,根據(jù)最大吸收波長判斷有可能是酚酸或黃酮類物質(zhì),純化和鑒定工作正在進行。

      由HPLC-DPPH實驗可知,棗花蜜中對DPPH自由基有清除作用的活性成分包含咖啡酸、對香豆酸、柚皮素和山奈酚,因此以清除率和IC50為指標(biāo)考察4種已知化合物質(zhì)量濃度為72μg/mL時的DPPH自由基清除能力,結(jié)果如表2所示。

      表2 4種活性成分對DPPH自由基清除率(x±s)Table 2 Scavenging capacities of four identified bioactive components on DPPH free radicals (x±s)

      由表2可知,咖啡酸、對香豆酸、柚皮素、山奈酚質(zhì)量濃度均為72μg/mL時,4種活性成分對DPPH自由基的清除作用強弱依次為:咖啡酸≈山奈酚>對香豆酸>柚皮素。在4種活性成分清除DPPH自由基的IC50實驗中,當(dāng)柚皮素質(zhì)量濃度高達5.44mg/mL時,其對DPPH自由基清除率僅為26.72%,而其他3種活性成分對DPPH自由基清除作用的IC50依次為山奈酚(59.01± 0.41)μmol/L、咖啡酸(69.37±0.33)μmol/L、對香豆酸(10.01±0.87)mmol/L。由此可知咖啡酸、對香豆酸、柚皮素和山奈酚對DPPH自由基的清除作用差異極大,山奈酚和咖啡酸的清除能力相當(dāng),山奈酚稍強一些,而對香豆酸和柚皮素的清除能力遠差于山奈酚和咖啡酸,不到二者的百分之一。

      2.2 抗氧化活性與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

      由清除DPPH自由基實驗可知,在相同質(zhì)量濃度(72 μg/mL)下,咖啡酸和對香豆酸對DPPH自由基的清除能力分別為96.56%和16.72%,說明咖啡酸對DPPH自由基的清除能力明顯強于對香豆酸,這可能與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。對于羥基肉桂酸類的酚酸類化合物,苯環(huán)有無羥基以及羥基的個數(shù)對其清除自由基的能力有顯著影響,隨著苯環(huán)上羥基數(shù)量的增加,清除自由基的能力顯著增強,尤其是苯環(huán)上3,4位的鄰羥基可以穩(wěn)定苯環(huán)供氫后的結(jié)構(gòu)[12]??Х人?3,4-二羥基肉桂酸)在苯環(huán)對位和間位上存在鄰位羥基結(jié)構(gòu),而且羥基對位含有給電子取代基團CHCHCOO-[12],見圖2,因此咖啡酸具有較強的DPPH自由基清除活性;而對香豆酸(4-羥基肉桂酸)苯環(huán)上少一個羥基且沒有鄰位羥基結(jié)構(gòu),見圖2,使其對DPPH自由基的清除能力明顯減弱。

      圖2 咖啡酸和對香豆酸分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structures of caffeic acid andp-coumaric acid

      圖3 柚皮素和山奈酚的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structures of naringenin and kaempferol

      山奈酚和柚皮素對DPPH自由基的清除能力分別為95.72%、11.12%,說明柚皮素對DPPH的清除率遠不及山奈酚。由圖3可知,山奈酚(3,5,7,4’-四羥基黃酮)含有4個羥基且3,5位的羥基會形成分子內(nèi)氫鍵;2,3位存在雙鍵會形成共軛效應(yīng)[12],這些結(jié)構(gòu)提高了山奈酚對DPPH自由基的清除能力,因而具有較強的抗氧化活性。柚皮素(5,7, 4'-三羥基黃酮)與山奈酚相比,不具有3,5位的羥基結(jié)構(gòu)且少1個羥基,因此對DPPH自由基的清除能力相對微弱。

      綜上所述,不同抗氧化活性成分的抗氧化能力與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。這一結(jié)果與付軍放[11]的研究結(jié)果一致。

      2.3 抗氧化活性成分含量測定

      本實驗采用HPLC法測定棗花蜜中對DPPH具有清除作用的4種已知活性成分的含量,結(jié)果見表3。

      表3 棗花蜜中4種活性成分含量(x±s)Table 3 Contents of four identified bioactive components in date honey (x±s)

      由表3可知,棗花蜜中4種已知活性成分的含量分別為:咖啡酸(48.8±0.2)μg/100g、對香豆酸(156.2± 7.9)μg/100g、柚皮素(741.3±9.4)μg/100g、山奈酚(157.3±6.1)μg/100g,它們的含量存在一定的差異,其中柚皮素的含量最高;對香豆酸和山奈酚含量相當(dāng),咖啡酸含量最低。

      3 結(jié) 論

      本實驗以棗花蜜為原料,采用HPLC-DPPH和清除DPPH自由基實驗研究棗花蜜中對DPPH自由基具有清除作用的活性成分。結(jié)果顯示:棗花蜜中存在1 2種對DPPH自由基具有清除作用的活性成分,各成分清除能力存在較大差異,活性成分中4種為已知化合物,其含量為咖啡酸(48.8±0.2)μg/100g、對香豆酸(156.2±7.9) μg/100g、柚皮素(741.3±9.4)μg/100g、山奈酚(157.3± 6.1)μg/100g;清除DPPH自由基能力最強的是山奈酚IC50為(59.01±0.41)μmol/L,其次是咖啡酸IC50為(69.37± 0.33)μmol/L,對香豆酸和柚皮素對DPPH自由基清除能力較弱,清除DPPH自由基能力的強弱與活性成分本身的分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

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      Analysis of Bioactive DPPH Free Radical Scavenging Components in Date Honey

      MU Xue-feng1,2,SUN Li-ping1,*,XU Xiang1,PANG Jie2
      (1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China;2. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

      The bioactive components in date honey having the ability to scavenge DPPH free radicals were quanlitatively and quantitatively analyzed by HPLC-DPPH. In total, 12 DPPH free radical scavenging components were found in date honey, and 4 of them were identified as caffeic acid, p-coumaric acid, naringenin and kaempferol. The contents of these components were in the range of 48.8 to 741.3 μg/100 g honey. The scavenging capacities of these bioactive components exhibited an obvious difference, which was highly correlated with the molecular structures of bioactive components.

      date honey;bioactive components;scavenging effect on DPPH free radicals;molecular structure

      S896.1

      A

      1002-6630(2010)21-0119-04

      2010-08-27

      國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(NYCYTX-43);科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2009GB23260456);中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研經(jīng)費項目

      穆雪峰(1983—),男,碩士研究生,研究方向為食品化學(xué)。E-mail:mxf3814@163.com

      *通信作者:孫麗萍(1963—),女,研究員,碩士,研究方向為蜂產(chǎn)品功能因子的分離與純化。E-mail:caasun@126.com

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