N+注入誘變選育混合糖發(fā)酵L-乳酸高產(chǎn)菌株

龐 銳，潘麗軍*，姜紹通，吳學(xué)鳳

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

N+注入誘變選育混合糖發(fā)酵L-乳酸高產(chǎn)菌株

龐 銳，潘麗軍*，姜紹通，吳學(xué)鳳

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

采用低能N+注入技術(shù)對(duì)米根霉As3.819進(jìn)行誘變選育，以提高該菌株利用混合糖(葡萄糖、木糖)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株的存活率曲線呈典型的“馬鞍型”，在注入劑量為50×2.5×1013ions/cm2時(shí)具有較高的正突變率。選育獲得突變株N50-7，其L-乳酸產(chǎn)量為79.42g/L，比出發(fā)菌株提高了17.75%，且遺傳穩(wěn)定性較好。對(duì)突變株N50-7的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了初篩，在混合糖150g/L(葡萄糖100g/L、木糖50g/L)、(NH4)2SO4 3.0g/L、KH2PO4 0.3g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、ZnSO4·7H2O 0.4g/L的條件下發(fā)酵72h，L-乳酸產(chǎn)量最高達(dá)到103.81g/L，較初篩前提高了30.71%。

離子注入；米根霉；誘變育種；混合糖；L-乳酸

L-乳酸是一種重要的有機(jī)酸，在食品、飲料、飼料、現(xiàn)代醫(yī)藥、現(xiàn)代農(nóng)藥、日用化工、造紙及電子等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景，是21世紀(jì)最具發(fā)展前途的有機(jī)酸之一[1-2]。隨著以L-乳酸為原料，制成可生物降解的新型環(huán)保材料——聚乳酸(PLA)加工和應(yīng)用技術(shù)的進(jìn)步[3-4]，作為原料的L-乳酸受到了人們的廣泛關(guān)注，已成為當(dāng)今世界最熱門的生化產(chǎn)品之一，市場(chǎng)需求量巨大[2]。

木質(zhì)纖維原料是地球上最豐富且價(jià)廉的可再生資源，水解得到同時(shí)含有葡萄糖和木糖等單糖的混合糖，是潛在的重要生物轉(zhuǎn)化原料[5-7]，對(duì)于降低L-乳酸生產(chǎn)成本具有重要意義。然而傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)是建立在利用淀粉質(zhì)原料的基礎(chǔ)上，對(duì)五碳糖利用度低。因此，篩選混合糖高效利用菌株，研究混合糖條件下微生物定向生物合成，是利用廉價(jià)可再生資源獲得能源產(chǎn)品和化學(xué)品的重要方向[8]。

離子注入誘變育種是集化學(xué)誘變、物理誘變?yōu)橐惑w的綜合誘變方法，不僅影響細(xì)胞的生理生化功能，還可使細(xì)胞中的染色體畸變、導(dǎo)致DNA鏈堿基的損傷、斷裂，從而使遺傳物質(zhì)在基因水平或分子水平上發(fā)生改變或缺失。因此，其能夠在低劑量注入的情況下顯著提高生物的變異率，獲得損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定的誘變效果[9-11]。離子注入技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于微生物優(yōu)良菌株的選育和改良研究中，為篩選高效的正突變菌株提供了廣闊的空間。

本工作擬利用N+注入的方式對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株米根霉As3.819進(jìn)行誘變處理，篩選能夠利用混合糖發(fā)酵高產(chǎn)L-乳酸的米根霉菌株，并對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，以獲得米根霉利用混合糖發(fā)酵L-乳酸的適宜條件，為木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)L-乳酸打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

米根霉(Rhizopus oryzae)As3.819 本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

篩選培養(yǎng)基：葡萄糖平板(g/L)：葡萄糖20、馬鈴薯200、瓊脂20、溴甲酚綠0.1、pH值自然；木糖平板(g/L)：木糖20、馬鈴薯200、瓊脂20、溴甲酚綠0.1、pH值自然。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80、(N H4)2SO44、KH2PO40.3、ZnSO4·7H2O 0.44、MgSO4·7H2O 0.25、CaCO310(單獨(dú)滅菌)，pH值自然。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80、木糖40、(NH4)2SO44、KH2PO40.3、ZnSO4·7H2O 0.25、MgSO4·7H2O 0.35、CaCO360(單獨(dú)滅菌)，pH值自然。

以上培養(yǎng)基皆于121℃滅菌15min。

1.3 培養(yǎng)方法

斜面及平板培養(yǎng)：32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d。

液體種子培養(yǎng)：100mL三角瓶裝液量20%，接種孢子懸液(濃度為1×106個(gè)/mL)2mL，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，32℃振蕩培養(yǎng)16h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：250mL三角瓶裝液量20%，接種量10%，32℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72h。

1.4 低能N+注入工藝與樣品處理

取新鮮活化斜面，用無菌水洗脫后制成濃度為1× 107個(gè)/mL的孢子懸液，吸取0.1mL均勻涂布于無菌培養(yǎng)皿上，以無菌風(fēng)吹干后進(jìn)行N+注入。離子注入在中國科學(xué)院等離子體物理研究所進(jìn)行，N+能量為15keV，注入劑量為0(對(duì)照)～2.5×1015ions/cm2，真空度為10-3Pa。離子注入后，將經(jīng)N+注入的培養(yǎng)皿和真空對(duì)照的培養(yǎng)皿分別用1mL無菌水洗脫，適當(dāng)稀釋后各取0.1mL涂布于PDA平板上，置32℃條件下倒置培養(yǎng)3～4d，用于單菌落的挑選和存活率的計(jì)算。

1.5 離子注入誘變效果的計(jì)算

1.5.1 存活率的計(jì)算

采用菌落計(jì)數(shù)法。分別統(tǒng)計(jì)真空對(duì)照組和離子注入組的菌落總數(shù)，按式(1)計(jì)算。

1.5.2 突變率的計(jì)算

挑取離子注入后的單菌落分別進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)試各菌株發(fā)酵混合糖的L-乳酸產(chǎn)量，以出發(fā)菌株作為對(duì)照，L-乳酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高5%的視為正突變，降低5%的視為負(fù)突變，在±5%之間的視為未突變。根據(jù)L-乳酸產(chǎn)量分別計(jì)算正突變率、負(fù)突變率和總突變率。按式(2)、(3)、(4)計(jì)算。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 L-乳酸含量的測(cè)定

采用EDTA定鈣法[12]。

1.6.2 發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y(cè)定

采用DNS與HPLC相結(jié)合的方法。

DNS法：殘?zhí)且云咸烟怯?jì)。發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，取上清液，采用DNS顯色法[13]測(cè)定殘?zhí)堑馁|(zhì)量濃度。HPLC法：色譜儀型號(hào)為Waters e2695，色譜柱為Waters Carbohydrate Analysis Column(3.9mm× 300mm)，檢測(cè)器為Waters 2424(ELS Detector)，進(jìn)樣量為10μL，流動(dòng)相流速為1mL/min。流動(dòng)相：75%乙腈-25%水；柱溫30℃。

1.6.3 生物量的測(cè)定

采用菌體干質(zhì)量法[13]。

1.7 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.7.1 N+注入誘變利用混合糖發(fā)酵L-乳酸高產(chǎn)突變株的篩選

通過計(jì)算N+注入后各劑量下菌株的致死率和正突變率，確定N+注入該菌株的最佳誘變劑量。在該劑量下對(duì)菌株反復(fù)誘變，依次通過葡萄糖平板、木糖平板對(duì)菌株進(jìn)行初篩，以獲得既能利用葡萄糖又能利用木糖高產(chǎn)L-乳酸的米根霉菌株。將各菌落的變色圈與原始菌株的變色圈相比，挑選變色圈大的保藏在PDA斜面上，用于搖瓶復(fù)篩。對(duì)復(fù)篩獲得的L-乳酸高產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的研究。

1.7.2 高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)基篩選

以玉米秸稈為例，其充分水解得到的混合糖中葡萄糖和木糖的質(zhì)量比約為2:1[7-8,14]，因此本實(shí)驗(yàn)混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基中葡糖糖和木糖以2:1的比例添加。分別對(duì)糖濃度、氮源種類、氮源濃度、磷酸鹽種類、磷酸鹽濃度、鎂離子濃度、鋅離子濃度各因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)篩選，以確定高產(chǎn)菌株利用混合糖發(fā)酵L-乳酸的適宜培養(yǎng)基組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 N+注入篩選混合糖發(fā)酵L-乳酸的高產(chǎn)突變株

2.1.1 誘變劑量

對(duì)米根霉As3.819采用N+注入誘變，在15keV注入能量下，統(tǒng)計(jì)不同劑量的存活菌落數(shù)。以0劑量存活菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算各注入劑量的存活率，繪制存活率曲線見圖1。分別在不同劑量下挑取一定量的單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定L-乳酸產(chǎn)量，同時(shí)與出發(fā)菌株對(duì)照計(jì)算突變率，其結(jié)果見圖2。

圖1 N+注入對(duì)菌體存活率的影響Fig.1 Survival rate of Rhizopus oryzae As3.819 implanted with N+ ions

由圖1可見，當(dāng)N+注入劑量低于20×2.5×1013ions/cm2時(shí)，菌體的存活率隨著注入劑量的增大而迅速降低；當(dāng)劑量達(dá)到30×2.5×1013ions/cm2后，存活率有短暫的回升，并在50×2.5×1013ions/cm2時(shí)達(dá)到最大值；此后隨著注入劑量的增加，菌體的存活率逐漸下降，整個(gè)過程呈“馬鞍型”變化曲線。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是：低劑量的N+注入時(shí)，能量沉積效應(yīng)和動(dòng)量轉(zhuǎn)移效應(yīng)的綜合作用，導(dǎo)致了DNA損傷和生物膜等大分子的損傷，造成了存活率的下降；中高劑量注入時(shí)存活率上升，可能是N+注入后電荷積累發(fā)揮了作用，激活了細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制和修復(fù)酶；高劑量N+注入時(shí)，細(xì)胞損傷程度大于其修復(fù)能力，電荷效應(yīng)也由于達(dá)到了臨界值而產(chǎn)生庫侖爆炸，保護(hù)屏障消失[15-17]。

圖2顯示，隨著注入劑量的增加，菌株的突變率也隨之增加；而正突變率則隨著注入劑量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在50×2.5×1013ions/cm2時(shí)菌株的正突變率最高；超過此劑量后，雖然菌體的突變率繼續(xù)增加，但正突變率呈下降趨勢(shì)。另外，在該注入劑量下菌體的負(fù)突變率低于正突變率，表明以該劑量進(jìn)行離子注入可獲得較多的正突變株，有利于篩選工作的進(jìn)行。

圖2 N+注入對(duì)菌株突變率的影響Fig.2 Effect of implantation dose of N+ ions on positive, negative and total mutant rate of Rhizopus oryzae As3.819

綜上所述，N+注入劑量在50×2.5×1013ions/cm2時(shí)，菌株的存活率為27.30%，且此劑量下菌株的正突變率最高?，F(xiàn)代育種理論認(rèn)為：被誘變微生物的致死率在75%左右即存活率在25%左右時(shí)產(chǎn)量性狀的正突變率較高，當(dāng)在更高的致死率下，雖然突變率可能較高，但是負(fù)突變往往很高，而正突變卻很低[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該理論基本相符。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇N+注入的誘變劑量為50×2.5×1013ions/cm2。

2.1.2 誘變篩選的高產(chǎn)菌株及遺傳穩(wěn)定性

采用最佳注入劑量50×2.5×1013ions/cm2對(duì)米根霉As3.819進(jìn)行N+注入誘變處理，按照1.7.1節(jié)中所述的方法篩選高產(chǎn)菌株。將初篩獲得的48株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定L-乳酸產(chǎn)量，得到了3株高產(chǎn)突變株。此3株菌的L-乳酸產(chǎn)量均比原始菌株提高了10%以上，分別命名為N50-7、N50-13和N50-36。

為了確保篩選到的高產(chǎn)突變株的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)以上實(shí)驗(yàn)中獲得的3株高產(chǎn)菌株進(jìn)行連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)。各菌株每傳一代重復(fù)3個(gè)搖瓶發(fā)酵測(cè)定L-乳酸產(chǎn)量，各代產(chǎn)量的平均值見表1。

表1 高產(chǎn)突變株的遺傳穩(wěn)定性Table 1 Genetic stability of three high-yield mutant strains

從表1可以看出，菌株N50-7的L-乳酸產(chǎn)量較高，且一直保持在79.40g/L左右，遺傳特征穩(wěn)定；而菌株N50-13開始的L-乳酸產(chǎn)量也比較高，但傳6代后產(chǎn)酸性能有所改變，L-乳酸產(chǎn)量迅速下降；菌株N50-36雖然具有很好的遺傳穩(wěn)定性，但其L-乳酸產(chǎn)量較其他兩個(gè)菌株低。因此，選擇N50-7作為利用混合糖發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的米根霉菌株進(jìn)行進(jìn)一步的研究。該菌株利用混合糖發(fā)酵L-乳酸的平均產(chǎn)量為79.42g/L，比出發(fā)菌株(67.45g/L)提高了17.75%。

2.2 高產(chǎn)菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基篩選

2.2.1 種齡對(duì)發(fā)酵的影響

在L-乳酸發(fā)酵中選擇適當(dāng)?shù)姆N齡非常重要，過老或太年輕的種子都會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生不利影響。太年輕的種子接種后使菌種前期的生長緩慢，發(fā)酵周期延長，產(chǎn)酸低。過老的種子雖然菌體量較多，但會(huì)出現(xiàn)菌體過早衰退的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致產(chǎn)酸能力下降[19]。因此，首先根據(jù)1.2.3節(jié)方法繪制米根霉N50-7菌體生長曲線，其結(jié)果見圖3。

圖3 菌體生長曲線Fig.3 Growth curve of N50-7

由圖3可知，該菌種在培養(yǎng)12h左右開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，之后菌體數(shù)量迅速增加；24h后菌體數(shù)量趨于穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定期?？梢姡摼甑膶?duì)數(shù)生長期應(yīng)在12～24h?？紤]到一般選用種齡在菌體處于分裂旺盛的對(duì)數(shù)生長中后期的菌種為宜，選擇了12～36h范圍內(nèi)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的種子液進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見圖4。

圖4 種齡對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of seed age on L-lactic acid production

從圖4可以看出，采用20～24h的種子液發(fā)酵，糖消耗的較完全，L-乳酸產(chǎn)量較高。而采用過早或過晚的種子，L-乳酸的產(chǎn)量都較低。因此采用培養(yǎng)20h的種子液接種發(fā)酵最好，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用培養(yǎng)20h的種子液進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 混合糖質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響

葡萄糖與木糖按質(zhì)量比2:1，選擇不同的混合糖濃度進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加混合糖質(zhì)量濃度分別為90、120、150、180g/L，觀察比較碳源濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5(殘?zhí)且云咸烟怯?jì)，計(jì)算轉(zhuǎn)化率)。

圖5 混合糖質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of total concentrations of glucose and xylose on L-lactic acid production

由圖5可知，混合糖質(zhì)量濃度在90～150g/L范圍內(nèi)，隨著葡萄糖、木糖質(zhì)量濃度的增加，L-乳酸的產(chǎn)量增加。當(dāng)混合糖質(zhì)量濃度為120g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，原料利用充分，但產(chǎn)酸量偏低；當(dāng)混合糖濃度為150g/L時(shí)，產(chǎn)酸量最高，但轉(zhuǎn)化率稍有下降；當(dāng)混合糖質(zhì)量濃度上升到180g/L時(shí)，產(chǎn)酸量有所下降且轉(zhuǎn)化率明顯減小。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選用混合糖質(zhì)量濃度為150g/L，其中葡萄糖100g/L，木糖50g/L。

2.2.3 氮源種類對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響

選取NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、尿素4種氮源，按照碳氮比180:1分別添加進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究不同氮源對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 氮源種類對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of nitrogen type on L-lactic acid production

由圖6可知，(NH4)2SO4作為氮源的乳酸產(chǎn)量最高，NH4NO3次之。實(shí)驗(yàn)最終選用(NH4)2SO4作為培養(yǎng)基中的氮源。

2.2.4 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響

分別添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g/L的硫酸銨進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of (NH4)2SO4 concentration on L-lactic acid production

由圖7可知，低質(zhì)量濃度的(NH4)2SO4對(duì)發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸有明顯的促進(jìn)作用，(NH4)2SO4質(zhì)量濃度越高，L-乳酸產(chǎn)量越高。當(dāng)培養(yǎng)基中(NH4)2SO4質(zhì)量濃度高于3.0g/L后，L-乳酸產(chǎn)量減小，所以(NH4)2SO4質(zhì)量濃度初步確定為3.0g/L。

2.2.5 磷酸鹽種類對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響

選擇KH2PO4、NH4H2PO4、NaH2PO4、Ca3(PO4)24種磷酸鹽作為此菌種磷元素的提供者進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖8。

圖8 磷酸鹽種類對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of phosphate type on L-lactic acid production

比較發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)酸量(圖8)可知，KH2PO4作為磷酸鹽優(yōu)于其他幾種磷酸鹽。因此，實(shí)驗(yàn)最終選用KH2PO4作為培養(yǎng)基中的磷酸鹽離子。

2.2.6 KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響

圖9 KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of KH2PO4 concentration on L-lactic acid production

分別添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的KH2PO4進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，隨著KH2PO4初始質(zhì)量濃度增大到0.3g/L，L-乳酸產(chǎn)量都會(huì)隨之增大。超過這個(gè)磷酸鹽添加量，L-乳酸產(chǎn)量反而會(huì)有所降低。因此，確定添加KH2PO4的最佳初始濃度為0.3g/L。

2.2.7 MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響

微生物在生長發(fā)酵過程中，需要磷、鎂、硫、鐵、鉀、鋅等元素作為酶的激活劑、生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)劑[19]。分別采用0.1～0.5g/L的MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究不同質(zhì)量濃度的ZnSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖10。

圖10 MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.10 Effects of MgSO4·7H2O and ZnSO4·7H2O concentrations on L-lactic acid production

由圖10可知，當(dāng)MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O質(zhì)量濃度分別為0.4g/L時(shí)，L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大值；而質(zhì)量濃度大于0.4g/L時(shí)，L-乳酸產(chǎn)量開始下降。分析其原因，應(yīng)該是Mg2+和Zn2+在低質(zhì)量濃度時(shí)，可以激活代謝途徑中某些關(guān)鍵酶的活性，對(duì)細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成有促進(jìn)作用，而高質(zhì)量濃度時(shí)則有抑制作用?？紤]到MgSO4·7H2O在質(zhì)量濃度為0.3～0.4g/L時(shí)，L-乳酸的產(chǎn)量相差甚微，從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，最終選取MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.3g/L，ZnSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.4g/L。

2.3 高產(chǎn)菌株的發(fā)酵特性

將經(jīng)N+注入篩選獲得的利用混合糖發(fā)酵L-乳酸的高產(chǎn)菌株N50-7按照以上實(shí)驗(yàn)得到的培養(yǎng)基組分進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔6h取樣檢測(cè)繪制發(fā)酵曲線，其結(jié)果見圖11。

乳酸發(fā)酵屬于初級(jí)代謝過程，由圖11可以看出，隨著生物量的積累，L-乳酸產(chǎn)量迅速增長；葡萄糖從6h開始用于產(chǎn)酸，42h時(shí)剩余量已很少，繼而木糖開始被大量利用，產(chǎn)酸量也有明顯的提高。72h達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，L-乳酸的產(chǎn)量為103.81g/L，較培養(yǎng)基初篩前提高了30.71%。

圖11 高產(chǎn)菌株發(fā)酵過程曲線Fig.11 Time courses of L-lactic acid production, glucose and xylose residues and cell biomass

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用N+注入技術(shù)對(duì)L-乳酸生產(chǎn)菌株——米根霉As3.819進(jìn)行誘變處理，經(jīng)不同劑量的N+注入后，菌株的存活率呈典型的“馬鞍型”曲線。在15keV、最佳注入劑量50×2.5×1013ions/cm2下，篩選得到1株具有良好遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)突變株N50-7，其利用混合糖發(fā)酵L-乳酸的產(chǎn)量為79.42g/L，較出發(fā)菌株提高了17.75%。與此同時(shí)，對(duì)N50-7的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了初步篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在葡萄糖100g/L、木糖50g/L、(NH4)2SO43g/L、KH2PO40.3g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、ZnSO4·7H2O 0.4g/L的條件下發(fā)酵72h，L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到103.81g/L，較培養(yǎng)基初篩前提高了30.71%。本研究可為今后利用木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)L-乳酸提供參考，具有較好的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。

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Breeding of High-yield L-Lactic Acid Strains for Co-fermentation of Glucose and Xylose by N+Implantation

PANG Rui，PAN Li-jun*，JIANG Shao-tong，WU Xue-feng
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In order to increase the production of L-lactic acid by co-fermentation of glucose and xylose, Rhizopus oryzae As3.819 was mutated by low energy N+ implantation. The results showed that the survival rate curve was a typical, , saddle shape , , with a high positive mutation rate at a dose of 50×2.5×1013ions/cm2. Under this implantation dose, strain N50-7 was obtained with high yield and stability. L-lactic acid yield by N50-7 was 79.42 g/L, 17.75% higher than the original strain. The optimal composition of fermentation medium for N50-7 were as follows: glucose 100 g/L, xylose 50 g/L, (NH4)2SO4 3 g/L, KH2PO4 0.3 g/L, MgSO4·7H2O 0.3 g/L and ZnSO4·7H2O 0.4 g/L. The final concentration of L-lactic acid was 103.81g/L after 72 h fermentation, which was 30.71% higher than that before breeding.

ion implantation；Rhizopus oryzae；mutation breeding；mixed sugars；L-lactic acid

Q815

A

1002-6630(2010)21-0248-06

2010-08-12

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z361)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(090411015)

龐銳(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称番F(xiàn)代加工理論、方法及工程化技術(shù)。E-mail：pangrui2008_happy@126.com

*通信作者：潘麗軍(1955—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品資源綜合利用。E-mail：panlijun1955@163.com