覆盆子糖蛋白的抗氧化作用

田 甜，段玉峰*，牛付閣

覆盆子糖蛋白的抗氧化作用

田 甜，段玉峰*，牛付閣

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

目的：研究覆盆子糖蛋白的體內(nèi)外抗氧化作用。方法：通過測(cè)定覆盆子糖蛋白粗提物的總還原能力及對(duì)羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2－·)和DPPH自由基的清除作用，證明覆盆子糖蛋白粗提物的體外抗氧化作用；并通過測(cè)定小鼠血清、肝臟、腦組織中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的變化，研究覆盆子糖蛋白粗提物對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化性的影響。結(jié)果表明：覆盆子糖蛋白粗提物可顯著增強(qiáng)小鼠血清、肝臟、腦組織中CAT、SOD、GSH-Px活性；并有一定的還原能力，并可有效地清除·OH、O2－·和DPPH自由基。結(jié)論：覆盆子糖蛋白具有明顯的抗氧化作用。

覆盆子；糖蛋白；自由基；抗氧化

覆盆子，今稱樹莓，為懸鉤子屬薔薇科，半灌木，小槳果類。覆盆子可做水果食用，其紅熟果稱樹莓果，口感香、甜、酸，可鮮食；其綠果經(jīng)炮制制成傳統(tǒng)中藥覆盆子。

覆盆子營(yíng)養(yǎng)豐富，是世界公認(rèn)的第三代黃金水果，具有抗衰老、減肥、治療泌尿道感染、抗癌防癌、抗氧化、保護(hù)心臟、防止心血管疾病等藥理作用[1]，具有良好的發(fā)展前景。目前對(duì)于覆盆子糖蛋白的體內(nèi)外抗氧化研究未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)研究覆盆子糖蛋白體內(nèi)外的抗氧化作用，以期為其藥理研究及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

覆盆子購(gòu)于西安市藥材市場(chǎng)，經(jīng)生藥學(xué)鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子(Rubus chingii Hu)的果實(shí)。

清潔級(jí)ICR小白鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量(22±2)g。

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)(生化試劑) 日本東京工業(yè)株式會(huì)社；GSH-PX試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒 南京建成生物工程研究所；考馬斯亮藍(lán)、肝素鈉、赤血鹽、三氯乙酸、鄰苯三酚、抗壞血酸(VC)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠；微量移液器 日本Nichiryo公司。

1.2 方法

1.2.1 覆盆子糖蛋白粗提物的制備

覆盆子烘干200g，粉碎過80目篩，經(jīng)石油醚80℃回流至無色，真空濃縮濾液至原體積的1/5，再用4倍體積的95%乙醇沉淀，低溫靜置過夜后離心，得沉淀物。用少量蒸餾水溶解沉淀物，重復(fù)兩次沉淀步驟。再加入沉淀物2～4倍體積的無水乙醇，攪拌均勻，3000r/min離心5min，棄掉上清液，然后依次加入丙酮、無水乙醚，再洗滌脫水各一次。放置40℃真空干燥箱中干燥，即得覆盆子糖蛋白粗品[2]。

1.2.2 覆盆子糖蛋白粗提物體外抗氧化活性研究

1.2.2.1 總還原能力測(cè)定

分別取0.5mL不同質(zhì)量濃度的覆盆子糖蛋白溶液(由1.2.1節(jié)產(chǎn)物制得)于具塞試管中，再加入2.5mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2.5mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液，迅速混勻，50℃水浴中反應(yīng)20min后急速冷卻，加入2.5mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸(TCA)，加蒸餾水定容到10mL，混勻后以3000r/m i n離心10min。取上清液2.5mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液0.5mL，混勻后用蒸餾水定容至5mL；10min后于波長(zhǎng)700nm處測(cè)定其吸光度。同質(zhì)量濃度BHT溶液作為對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值[3]。

1.2.2.2 對(duì)超氧陰離子自由基(O2－·)的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化體系[4-5]。計(jì)算每個(gè)樣品質(zhì)量濃度下的平均自氧化速率，按照式(1)計(jì)算對(duì)O2－·的抑制率。

式中：X0為空白溶液的自氧化速率；X1為樣品溶液的自氧化速率。

1.2.2.3 對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用

采用Fenton分光光度法[5-6]。按照式(2)計(jì)算對(duì)·OH的清除率。

式中：A0為不加樣品溶液時(shí)所測(cè)吸光度； AS為加入樣品溶液反應(yīng)后所測(cè)吸光度；AX為不加鄰二氮菲時(shí)所測(cè)吸光度。

1.2.2.4 對(duì)DPPH自由基的清除作用

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈現(xiàn)強(qiáng)紫色，在5 1 7 n m波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，加入抗氧化劑后，517nm波長(zhǎng)處的吸光度減弱。將覆盆子糖蛋白和VC分別配成等質(zhì)量濃度的溶液，吸取0.5mL樣品和0.5mL水于試管中，混勻后，再加入2mL 0.25mmol/L DPPH溶液(95%乙醇配制)充分搖勻，在室溫下避光保存20min，然后在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并以VC作陽性對(duì)照，以95%乙醇調(diào)零，每個(gè)處理試樣平行測(cè)定3次，取其平均值[7]。按式(3)計(jì)算各試樣對(duì)DPPH自由基的清除率。

式中：A0為0.5mL 95%乙醇+0.5mL水+2mL DPPH的吸光度；AS為0.5mL試樣+0.5mL水+2mL DPPH的吸光度；AX為0.5mL試樣+0.5mL水+2mL95%乙醇的吸光度。

1.2.3 覆盆子糖蛋白粗提物體內(nèi)抗氧化活性研究

1.2.3.1 動(dòng)物的分組及飼喂

選取健康小鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組和低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半。對(duì)照組每日灌胃生理鹽水，低、中、高劑量組每日定時(shí)灌胃覆盆子糖蛋白粗提物，劑量分別為200、400、800mg/(kg bw·d)。各組自由飲水，自由攝食，飼喂4周。末次灌胃后禁食1 2 h，摘除眼球進(jìn)行眼眶采血，迅速解剖取出肝、腦、腎、胸腺、脾、心臟等臟器，冷凍備用[8]。

1.2.3.2 血樣及組織勻漿的制備

血清制備：取血試管預(yù)先加入肝素抗凝劑，并低溫烘干。取血后，搖勻，立即于冰浴中冷卻，并于3000r/min離心5min，分離血清，然后將血清傾入另一潔凈試管低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

組織勻漿的制備：取適量濕組織加生理鹽水按1:5 (m/V)在冰浴條件下用組織勻漿機(jī)制成勻漿，并于8000～10000r/min離心10min，將上清液傾入另一潔凈試管低溫保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.3.3 組織勻漿蛋白含量的測(cè)定

不同組織勻漿中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定均采用考馬斯亮藍(lán)法[9]。

1.2.3.4 過氧化氫酶(CAT)活力的測(cè)定

采用鉬酸銨比色法[10]。計(jì)算公式：

血清CAT活性/(U/mL)＝(對(duì)照管吸光度－測(cè)定管吸光度) ×271×1.0mL÷60s÷取樣量×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù) (4)

組織勻漿中CAT活性/(U/mg pro) ＝ (對(duì)照管吸光度－測(cè)定管吸光度)×271×1.0mL÷60s÷取樣量 ×1%勻漿蛋白含量(mg pro/mL) (5)

1.2.3.5 超氧化物歧化酶(SOD)活力的測(cè)定

采用黃嘌呤氧化酶法[11]。計(jì)算公式：

血清中SOD活性/(U/mL)=(對(duì)照管吸光度－測(cè)定管吸光度)÷對(duì)照管吸光度÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù) (6)

組織中SOD活性/(U/mg pro)=(對(duì)照管吸光度－測(cè)定管吸光度)÷對(duì)照管吸光度÷50%×反應(yīng)液總體積÷取樣量(mL)÷組織中蛋白含量(mg pro/mL) (7)

1.2.3.6 谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)活力的測(cè)定

采用二硫?qū)ο趸郊姿?DTNB)法[9]。計(jì)算公式：

血清中GSH-Px活性/(U/mL)＝(非酶管吸光度－酶管吸光度)÷(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20μmol/L)×稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù) (8)

組織中GSH-Px活性/(U/mg pro)＝(非酶管吸光度－酶管吸光度)÷(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20μmol/L)×稀釋倍數(shù)÷反應(yīng)時(shí)間÷待測(cè)樣本蛋白含量(mg pro/mL) (9)

1.2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

使用DPS 3.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 覆盆子糖蛋白粗提物體外抗氧化活性研究

2.1.1 總還原能力測(cè)定

圖1 還原能力的測(cè)定Fig.1 Concentration-dependent reducing power of RGP

由圖1可知，覆盆子糖蛋白粗提物具有較好的還原能力，隨質(zhì)量濃度增大，還原能力增強(qiáng)，且質(zhì)量濃度在200～500mg/L范圍內(nèi)與還原力呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系。

2.1.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

圖2 清除超氧陰離子自由基效果Fig.2 Concentration-dependent scavenging effect of RGP on superoxide anion free radicals

由圖2可知，覆盆子糖蛋白粗提物對(duì)超氧陰離子自由基具有較好的清除能力，在10～20mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除率直線上升，在20～80mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增大，清除能力逐漸增強(qiáng)，且呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

2.1.3 對(duì)羥自由基的清除作用

圖3 清除羥自由基效果Fig.3 Concentration-dependent scavenging effect of RGP on hydroxyl free radicals

由圖3可知，覆盆子糖蛋白粗提物溶液對(duì)羥自由基具有較好的清除能力，隨質(zhì)量濃度增大，清除能力逐漸增強(qiáng)，并在200～1000mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其回歸曲線為Y=33.76617+0.03133X，R2=0.994553。

2.1.4 對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖4 清除DPPH自由基效果Fig.4 Non-concentration-dependent scavenging effect of RGP on DPPH free radicals

由圖4可知，在對(duì)DPPH自由基的清除實(shí)驗(yàn)中，覆盆子糖蛋白粗提物對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用。但隨著質(zhì)量濃度增大清除率變化不大，未呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.2 覆盆子糖蛋白粗提物體內(nèi)抗氧化活性研究

2.2.1 過氧化氫酶含量的變化

表1 覆盆子糖蛋白對(duì)小鼠體內(nèi)相關(guān)組織中CAT活力的影響(x±s，n=9)Table 1 Effect of RGP on CAT activity in relevant tissues of mice(x±s，n=9)

由表1可知，3個(gè)劑量組的小鼠血清和肝臟中CAT的活性都隨劑量增大而增大，相對(duì)對(duì)照組，血清高劑量組中達(dá)到極顯著差異，肝臟中、高劑量組都達(dá)到了

極顯著差異。表明服用一定劑量的覆盆子糖蛋白粗提物可提高小鼠血清及肝組織中CAT的活性。

2.2.2 超氧化物歧化酶活力的測(cè)定

表2 覆盆子糖蛋白對(duì)小鼠體內(nèi)相關(guān)組織SOD活力的影響(x±s，n=9)Table 2 Effect of RGP on T-SOD activity in relevant tissues of mice(x±s，n=9)

由表2可知，隨著劑量的增大，血清、肝臟和腦組織中SOD活力與對(duì)照組比較均有所增大。其中低劑量組與對(duì)照組無顯著差異，中、高劑量組與對(duì)照組均達(dá)到了極顯著差異。表明服用覆盆子糖蛋白粗提物達(dá)到一定劑量可顯著提高SOD的活性。

2.2.3 谷胱甘肽-過氧化物酶活力的測(cè)定

表3 覆盆子糖蛋白粗提物對(duì)小鼠體內(nèi)相關(guān)組織GSH-PX活力的影響(±s，n=9)Table 3 Effect of RGP on GSH-PXactivity in relevant tissues of mice(±s，n=9)

表3 覆盆子糖蛋白粗提物對(duì)小鼠體內(nèi)相關(guān)組織GSH-PX活力的影響(±s，n=9)Table 3 Effect of RGP on GSH-PXactivity in relevant tissues of mice(±s，n=9)

組別血清GSH-Px活肝臟GSH-Px活腦組織GSH-PX活力/(U/mL)力/(U/mg pro)力/(U/mg pro)對(duì)照組42.66±3.1538.95±3.0615.54±1.95低劑量組51.49±3.1843.53±3.8818.36±0.97*中劑量組59.40±2.85**45.59±4.83*20.09±1.82**高劑量組68.34±5.02**51.74±3.04**28.96±2.07**

由表3可知，隨劑量的增大，小鼠血清、肝組織和腦組織中的GSH-Px活力越來越高。相對(duì)于對(duì)照組，腦組織低劑量組達(dá)到了顯著差異，血清和腦組織中、高劑量組都達(dá)到極顯著差異，肝臟中劑量組達(dá)到了顯著差異，高劑量組中達(dá)到了極顯著差異。表明服用一定劑量的覆盆子糖蛋白粗提物能提高小鼠體內(nèi)的GSH-Px活性，并有量效關(guān)系，因此覆盆子糖蛋白粗提物具有明顯的抗氧化作用。

3 結(jié) 論

目前公認(rèn)抗氧化劑有兩大類：第一類為預(yù)防性抗氧化劑。此類抗氧化劑可以清除鏈引發(fā)階段的自由基，如SOD、CAT等酶以及金屬離子絡(luò)合劑；第二類氧化劑為斷鏈型抗氧化劑，可以捕捉自由基反應(yīng)鏈中的過氧自由基，阻止或延緩自由基鏈反應(yīng)的進(jìn)行。

覆盆子糖蛋白有一定的還原能力，并可有效地清除·OH、O2－·和DPPH自由基，可顯著增強(qiáng)小鼠血清、肝臟、腦組織中CAT、SOD、GSH-Px活性。表明覆盆子糖蛋白在抗氧化反應(yīng)中不僅能清除鏈引發(fā)階段的自由基，而且可以直接捕獲自由基反應(yīng)鏈中的自由基，阻斷自由基鏈反應(yīng)，起到預(yù)防和斷鏈的雙層作用，是良好的自由基清除劑。

[1]賀冰, 尤昭玲. 淺談補(bǔ)腎要藥: 覆盆子的應(yīng)用[J]. 湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2004, 10(5): 66-68.

[2]張鐘, 高智謀, 錢仁珊. 紅棗多糖提取工藝及其理化性質(zhì)的研究[J].保鮮與加工, 2006, 32(1): 80-83.

[3]CHEN Yong , WANG Mingfu , ROSEN R T, et al. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydra- zyl radical-scavenging active components from Polygonum multiflorum Thunb[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 4(7): 226-228.

[4]許雅娟, 趙艷景, 胡虹. 鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶活性的研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 32(6): 1207-1209.

[5]何玲玲, 王新, 石中亮, 等. 水提板栗殼色素對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用[J]. 食品與機(jī)械, 2006, 22(6): 56-57.

[6]楊明惠, 何麗仙, 李珍貴. 分光光度法測(cè)定Fenton體系中產(chǎn)生的羥自由基[J]. 大理學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 6(4): 38-40.

[7]CHOW S T, CHAO W W, CHUNG Y C. Antioxidative activity and safety of 50% ethaolic red extract[J]. Journal of Food Science, 2003, 68 (1): 21-251.

[8]施新酉. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1980: 103-104.

[9]張清安, 李建科, 李澤珍. 核桃油對(duì)小鼠肝臟與腦組織的抗氧化作用[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2004, 24(5): 408-409.

[10]馬世玉, 李莉, 吳基良, 等. 竹葉提取液對(duì)小鼠的抗氧化作用[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2004, 9(5): 585-587.

[11]鄒國(guó)林, 桂興芬, 鐘曉凌, 等. 一種SOD的測(cè)活方法: 鄰苯三酚自氧化法的改進(jìn)[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1986(4): 71-73.

Antioxidant Effect of Raspberry Glycoprotein

TIAN Tian，DUAN Yu-feng*，NIU Fu-ge,
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi an 710062, China)

Objective: To investigate the antioxidant activity of raspberry glycoprotein (RGP) in vitro and in vivo. Methods: The antioxidant activity of raspberry glycoprotein in vitro was evaluated by determining its reducing power and scavenging capacities against hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals. The activities of CAT, SOD and GSH-PX in serum, liver and brain tissues of mice were determined to evaluate the antioxidant activity of raspberry glycoprotein in vivo. Results: Raspberry glycoprotein significantly increased the activities of CAT, SOD and GSH-PXin serum, liver and brain tissues of mice, revealed strong reducing power, and effectively eliminated hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals. Conclusion: Raspberry glycoprotein has obvious antioxidant effect.

raspberry；glycoprotein；free radical；antioxidation

TS201.2

A

1002-6630(2010)21-0357-04

2010-03-01

田甜(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：tiantiansweetie@126.com

*通信作者：段玉峰(1955—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：yfduan@snnu.edu.cn