東海海參多糖酶解提取工藝優(yōu)化

徐 逯，葉立斌，于 平，勵(lì)建榮*

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035)

東海海參多糖酶解提取工藝優(yōu)化

徐 逯，葉立斌，于 平，勵(lì)建榮*

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035)

將現(xiàn)代酶解技術(shù)應(yīng)用于東海海參多糖提取工藝，選取胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳蛋白酶為胃蛋白酶，并通過(guò)響應(yīng)面分析方法以多糖得率為響應(yīng)值優(yōu)化酶解工藝。結(jié)果表明，酶解工藝最優(yōu)條件為胃蛋白酶用量(m/m)0.95%、酶解溫度56℃、酶解時(shí)間6h、酶解液pH1。在此條件下海參多糖得率為1.65%，該值與響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)值1.59%基本相符。

東海海參；多糖；蛋白酶；響應(yīng)面分析

東海海參(Acaudina molpadioides Semper)，又名海茄子，屬于棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata)，海參綱(Holothurioider)，生長(zhǎng)于海洋底層巖石上或海藻間，為海洋中重要的食物和藥物資源。其蘊(yùn)藏量相當(dāng)豐富，目前約為106噸。由于受加工技術(shù)的限制，東海海參深加工的產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展相對(duì)滯后，因而漁民即使捕獲也放歸大海[1]。研究表明，海參體壁所含的一種酸性黏多糖是一種有別于一般多糖類的含有糖醛酸和氨基糖殘基的多糖[2]，海參黏多糖是一類高度硫酸酯化并經(jīng)巖藻糖基側(cè)鏈修飾的軟骨素型聚糖[3]，海參酸性黏多糖具有降血壓、抗癌作用[4-7]、提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能[8-9]，對(duì)抗新生血管形成等[10-11]。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)東海海參多糖的提取工藝進(jìn)行研究，為進(jìn)一步的海參酸性黏多糖提取打下基礎(chǔ)。

以東海海參為原料，采用酶解技術(shù)，對(duì)酶解過(guò)程中的溫度、時(shí)間、pH值、加酶量等條件進(jìn)行研究，運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化東海海參多糖提取工藝，為東海海參的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東海海參 寧?？h東部海洋經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)有限公司；胰蛋白酶(262U/g)、胃蛋白酶(3000～3500NFU/mg)、木瓜蛋白酶(52U/mg) Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) Shimadzu公司；Forma-86C型超低溫冰箱 Thermo Electron公司；DZG-6090型真空干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速離心機(jī)；Delta320型pH酸度計(jì) Mettler Toledo公司；HH-2、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 東海海參酶解前處理工藝

工藝流程：東海海參→水發(fā)除鹽→切碎→冷凍干燥→堿解→酶解→離心除沉淀→海參多糖酶解液

工藝要點(diǎn)：1)水發(fā)除鹽：用自來(lái)水常溫浸泡16h，使干海參膨脹，并使其所含鹽分降低。2)切碎：東海海參表面積的大小會(huì)影響酶解效果，將東海海參切成塊狀即可。3)冷凍干燥：為計(jì)算精確的多糖得率，將原料冷凍干燥后進(jìn)行酶解。4)堿解：以6倍0.5mol/L的K2CO3在60℃條件下堿解1.5h。5)酶解：加入一定量的蛋白酶，保持一定的酶解時(shí)間，通過(guò)苯酚硫酸法，以多糖得率為指標(biāo)確定最佳酶解工藝。

1.3.2 酶水解工藝路線

將原料用粉碎機(jī)粉碎，取5g，以30mL 0.5mol/L K2CO3在60℃條件下堿解1.5h，然后用6mol/L HCl調(diào)pH值后進(jìn)行酶解，以多糖得率為指標(biāo)，分別改變?nèi)芤簆H值、加酶量、溫度、時(shí)間4個(gè)因素對(duì)蛋白酶的種類及各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化。苯酚硫酸法[12]測(cè)定多糖含量，計(jì)算多糖得率。

1.3.3 多糖得率的計(jì)算

式中：多糖質(zhì)量濃度通過(guò)苯酚硫酸法[12]測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類對(duì)酶解效果的影響

蛋白酶種類對(duì)糖蛋白的作用有一定影響，進(jìn)而影響酶解效果。取相同量的東海海參粉末，在酶用量0.4%、溫度50℃條件下酶解4h，考察不同蛋白酶對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蛋白酶種類對(duì)酶解效果的影響Table1 Effect of proteases on polysaccharide yield

由表1可見(jiàn)，在酶用量相同的情況下，以胃蛋白酶作用后的多糖得率為最高，可以達(dá)到1.2%，這是由于胃蛋白酶是一種酸性蛋白酶，能分解蛋白質(zhì)中由芳香族氨基酸或酸性氨基酸所形成的肽鍵，故能催化酪蛋白、球蛋白、組蛋白，動(dòng)物的角、指甲和羽毛中的角蛋白，以及催化植物蛋白等的水解，而胰蛋白酶只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵，重金屬離子、有機(jī)磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制劑對(duì)其活性有強(qiáng)烈抑制，木瓜蛋白酶對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，同時(shí)，還具有合成功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質(zhì)[13]。由于本實(shí)驗(yàn)所用原料為海產(chǎn)品，所以其中所含物質(zhì)會(huì)對(duì)胰蛋白酶造成抑制，而木瓜蛋白酶的蛋白合成作用會(huì)對(duì)多糖得率有一定影響，所以有此確定蛋白酶的選取為胃蛋白酶，進(jìn)而對(duì)其酶解條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以期達(dá)到最高得率。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)胃蛋白酶酶解效果的影響

圖1 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis duration on polysaccharide yield

由圖1可知，隨著酶解的進(jìn)行，海參中的蛋白質(zhì)不斷降解為肽和氨基酸與糖鏈分離，多糖得率隨之增加，但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使酶解液腐敗并使成本增加，理論上講，在反應(yīng)進(jìn)行到一定程度后，隨著底物減少，酶活力下降，酶解也會(huì)趨于平緩。因此，以多糖得率來(lái)確定最優(yōu)酶解時(shí)間為6h。

2.3 酶用量對(duì)胃蛋白酶酶解效果的影響

圖2 酶用量對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzyme load on polysaccharide yield

在確定酶解時(shí)間6h后，固定pH2，溫度50℃條件下，對(duì)加酶量進(jìn)行選擇。結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，樣品酶解時(shí)隨著胃蛋白酶用量的增加，海參多糖的得率呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)胃蛋白酶用量(m/m)超過(guò)0.8%時(shí)，得率開(kāi)始呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是由于酶與底物之間的濃度達(dá)到飽和，再增加酶用量，酶解作用較小。因此，選擇酶用量為0.8%。

2.4 pH值對(duì)胃蛋白酶酶解效果的影響

酶解時(shí)，pH值過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響胃蛋白酶的活性。在酶解時(shí)間6h、加酶量0.8%、溫度50℃條件下酶解，考察不同pH值對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 pH值對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of initial pH on polysaccharide yield

由圖3可見(jiàn)，pH值由0.5增至1時(shí)多糖得率有所增加，當(dāng)pH值達(dá)到1后，隨著pH值的增加，多糖得率逐漸減少。這是因?yàn)槲傅鞍酌甘撬嵝缘鞍酌?，在酸性條件下活性最強(qiáng)，隨著pH值的增加其活性會(huì)受到抑制，而鹽酸用量過(guò)多會(huì)對(duì)多糖進(jìn)行降解，因此，選擇pH1進(jìn)行酶解。

2.5 酶解溫度對(duì)胃蛋白酶酶解效果的影響

每種蛋白酶都有各自的最適作用溫度，溫度過(guò)低或者過(guò)高都會(huì)影響其活性。在pH1、加酶量0.8%條件下酶解6h，考察不同酶解溫度對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)胃蛋白酶酶解效果的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on polysaccharide yield

由圖4可知，在40～55℃酶解溫度范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高，海參多糖得率逐漸增加；酶解溫度大于55℃時(shí)，再增加酶解溫度，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。酶解溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響是多方面的，包括對(duì)酶催化反應(yīng)的速度和對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。溫度升高時(shí)，酶催化反應(yīng)的速度大大加快，而酶的穩(wěn)定性隨著酶解溫度升高而變差，當(dāng)這兩種效應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)即為酶的最適溫度，酶活力最大[14]。最適酶解溫度為55℃。

2.6 采用響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶酶解工藝條件

2.6.1 分析因素的選取及分析方案

根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15]，選取海參多糖提取的酶解時(shí)間(A)、酶解溫度(B)、pH值(C)、酶用量(D)為自變量，多糖得率為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面法分析因素及水平Table2 Factors and levels in the response surface design

2.6.2 響應(yīng)面分析與試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table3 Response surface design layout and experimental results

取27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，分為24個(gè)析因點(diǎn)和3個(gè)零點(diǎn)。其中析因點(diǎn)為自變量，取值在A、B、C、D所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)上；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)重復(fù)3次，以估計(jì)試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6.3 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用Design 7.0軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得回歸方程：

R= 1.36－0.049a＋0.040b－0.17c＋0.16d－0.071ab＋0.19ac－0.006357ad－0.12bc＋0.055bd－0.18cd－0.21a2－0.23b2－0.12c2－0.29d2

式中：a=(A－6)/2，b=(B－55)/10，c=(C－2)/1，d=(D－0.8)/0.4；a、b、c、d為編碼值，A、B、C、D為真實(shí)值，R為多糖得率/%。

對(duì)模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果Table4 Significance test for regression coefficients of the established regression model

表5 模型檢定結(jié)果的分析Table5 Results of statistical evaluation of the established regression model

由表4、5可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)試驗(yàn)擬合良好，模型P=0.0178＜0.05，表明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著。失擬項(xiàng)P= 0.0571＞0.05，說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)的擬合度較好，此方法可靠。表5表明各因素對(duì)多糖得率的影響不同，其中酶解pH值影響最大，酶用量次之，均達(dá)極顯著水平；酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)多糖得率無(wú)顯著影響；酶用量與酶解溫度的交互項(xiàng)達(dá)到顯著水平。

2.6.4 響應(yīng)面分析圖

通過(guò)多元回歸方程分析得知4個(gè)因素及其交互作用對(duì)多糖得率的影響情況。該影響可以用響應(yīng)曲面和等高線來(lái)表示。圖5～10分別表示酶解溫度與酶解時(shí)間、酶解pH值與酶解時(shí)間、酶解加酶量與酶解時(shí)間、酶解pH值與酶解溫度、酶解加酶量與酶解溫度、酶解加酶量與酶解pH值，6組因素對(duì)海參多糖胃蛋白酶酶解效果的影響。

圖5 多糖得率=f(A,B)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis temperature and duration

圖6 多糖得率=f(A,C)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis duration and initial pH

圖7 多糖得率=f(A,D)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis duration and enzyme load

圖8 多糖得率=f(B,C)的響應(yīng)面和等高圖Fig.8 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis temperature and initial pH

圖9 多糖得率=f(B,D)的響應(yīng)面和等高圖Fig.9 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis temperature and enzyme load

圖10 多糖得率 =f(C、D)的響應(yīng)面和等高圖Fig.10 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of enzyme load and initial pH

RSM圖形是指在其他因素水平固定的條件下，響應(yīng)值與試驗(yàn)中兩因素所構(gòu)成的三維曲面圖，可直觀地反映各因素之間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。圖5～10直觀的給出了各個(gè)因素交互作用響應(yīng)面的3D圖和等值線圖。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等值線可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值。

2.6.5 最佳酶解條件

由Design軟件的嶺脊分析得到海參多糖的最佳酶解條件，即酶解時(shí)間5.42h，酶解溫度56.19℃，酶解液pH1.12，胃蛋白酶用量0.95%。在此條件下海參多糖的得率為1.59%。為檢驗(yàn)RSM法的可靠性，采用上述最佳酶解條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。考慮到實(shí)際操作，將最佳酶解條件修正為酶解時(shí)間6h、酶解溫度56℃、酶解液pH1、胃蛋白酶用量0.95%。在此條件下海參多糖得為1.65%。與理論預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明該回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對(duì)海參多糖酶解效果的影響情況。

3 結(jié) 論

用胃蛋白酶提取海參多糖，獲得具有較高多糖得率的酶解液，為海參酸性黏多糖的制備提供研究基礎(chǔ)。利用響應(yīng)面分析得出優(yōu)化的酶解工藝條件為酶解時(shí)間6h、酶解溫度56℃、酶解液pH1、胃蛋白酶用量0.95%，在此最優(yōu)工藝條件下，多糖得率可達(dá)到1.65%，該值與響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)值1.59%基本相符，說(shuō)明響應(yīng)面模型可優(yōu)化酶解工藝條件。

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Optimization of Enzymatic Polysaccharide Extraction from Acaudina molpadioides Semper by Response Surface Methodology

XU Lu，YE Li-bin，YU Ping，LI Jian-rong*
(Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

Papain, pepsin and trypsin were chosen to conduct the single enzyme hydrolysis of Acaudina molpadioides Semper for polysaccharide extraction, and pepsin was the selected enzyme due to the highest polysaccharide yield. The hydrolysis of Acaudina molpadioides Semper with pepsin was optimized by response surface methodology in order to improve polysaccharide yield. The optimal conditions for pepsin hydrolysis were found to be: enzyme load, 0.95%; hydrolysis temperature, 56 ℃; initial pH, 1; and hydrolysis duration, 6 h. An experimental polysaccharide yield of 1.65% was obtained under these conditions, which basically accorded with the model predicted value of 1.59%.

Acaudina molpadioides Semper；polysaccharide；enzymoysis；response surface methodology

TQ929.2

A

1002-6630(2010)20-0061-06

2010-01-07

徐逯(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ芤蜃?。E-mail：xuluyaya12345@126.com

*通信作者：勵(lì)建榮(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品、水產(chǎn)品貯藏加工與安全控制。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn