李 斌，董明盛*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

黑木耳提取物對(duì)細(xì)菌群體感應(yīng)及生物膜形成的抑制作用

李 斌，董明盛*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

采用報(bào)告菌平板法檢測(cè)黑木耳甲醇粗提物對(duì)細(xì)菌群體感應(yīng)現(xiàn)象的抑制作用，同時(shí)，采用微孔板法和菌落計(jì)數(shù)法研究黑木耳粗提物對(duì)大腸桿菌Escherichia coli 8099生物膜形成的影響。結(jié)果表明：黑木耳粗提物能有效抑制大腸桿菌生物膜的形成，0.3g/mL黑木耳粗提物的抑制率可以達(dá)到72.16%。

細(xì)菌群體感應(yīng)；黑木耳；生物膜；抑制

“群體感應(yīng)”(quorum-sensing，QS)[1]是指細(xì)菌的數(shù)量(quorum)達(dá)到一定的密度時(shí)才能發(fā)生的感應(yīng)現(xiàn)象(sensing)。當(dāng)一個(gè)特定環(huán)境中的細(xì)菌數(shù)量增加時(shí)，由細(xì)菌的LuxⅠ蛋白所合成的信息分子的濃度也會(huì)相應(yīng)的升高，當(dāng)信號(hào)分子積累到一定的濃度后，就能和細(xì)胞質(zhì)中信號(hào)分子的受體蛋白相結(jié)合，引起受體蛋白構(gòu)象變化，進(jìn)一步激活靶基因的表達(dá)，展現(xiàn)出新的行為特征，比如生物發(fā)光、毒性基因的表達(dá)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、細(xì)菌的群游和生物膜的形成等[2]。

細(xì)菌生物膜是指由附著于惰性或者活性實(shí)體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹著細(xì)菌的水合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落[3]?，F(xiàn)已證明，很多久治不愈的慢性細(xì)菌性感染與生物膜有關(guān)。細(xì)菌可在人體組織如牙齒、皮膚、肺、尿道及其他器官的表面形成生物膜，引起諸如肺囊性纖維化，彌漫性泛細(xì)支氣管炎，牙周炎，膽道感染，心瓣膜性心內(nèi)膜炎等[4-5]。細(xì)菌能黏附大多數(shù)醫(yī)療器械的材料表面并形成生物膜，如靜脈導(dǎo)管、導(dǎo)尿管、氣管插管、人工心臟瓣膜、隱型眼鏡等[6-7]。此外，生物膜細(xì)菌還可污染與人類生活相關(guān)的供水系統(tǒng)、空調(diào)系統(tǒng)和食品加工設(shè)備等，由此造成傳染病的流行[8-9]。據(jù)估計(jì)，大約65%人類細(xì)菌性感染是由生物膜細(xì)菌引起的。群體感應(yīng)抑制劑在降低細(xì)菌致病力的同時(shí)，又不會(huì)致使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，因此利用它來控制生物膜的形成引起了人們廣泛的關(guān)注。

黑木耳(Auricularia auricular)隸屬真菌門、擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，是著名藥食兼用真菌。子實(shí)體除含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有豐富的B族維生素以及鈣、磷、銅等有益元素。黑木耳多糖還具有抗腫瘤、抗血栓、抗衰老、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等功能[10]。從木耳子實(shí)體中分離的黑刺菌素(adustin)有抗真菌作用。我國(guó)是世界上主要的黑木耳生產(chǎn)國(guó)，人工栽培起源于我國(guó)，年產(chǎn)

量占世界總產(chǎn)量的90%以上，它在我國(guó)多數(shù)地區(qū)都有生產(chǎn)，已有1000多年記載歷史。深入研究黑木耳的主要活性功能成分，探索其對(duì)人類的有益作用，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及其特性

紫色桿菌(C. violaceum CV026)由美國(guó)德克薩斯州立大學(xué)McLean J C教授惠贈(zèng)，是野生菌株Chromobacterium violaceum ATCC 31532的mini-Tn5突變體，卡那霉素抗性，用量為20μg/mL，本身不產(chǎn)生AHLs，也不產(chǎn)生紫色，當(dāng)外源AHLs存在時(shí)，回復(fù)產(chǎn)生特征性紫色，C. violaceum CV026的CviR對(duì)側(cè)鏈長(zhǎng)度為C4到C8的AHLs不同程度的敏感[11-12]。該菌株在LB培養(yǎng)基中28℃搖床培養(yǎng)。

Escherichia coli 8099本實(shí)驗(yàn)室保存，在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。

1.2 試劑與設(shè)備

卡那霉素、C6-HSL 美國(guó)Sigma公司。

RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 樣品處理

攔水壩的修建反映了當(dāng)?shù)厝嗣裼械钟匀粸?zāi)害的意識(shí)和修建防御工程的聰明才智，反映了少數(shù)民族應(yīng)對(duì)復(fù)雜自然環(huán)境所具備的獨(dú)特的智慧。

市購(gòu)黑木耳子實(shí)體(產(chǎn)地黑龍江綏陽)，經(jīng)35℃恒溫烘干24h，粉碎，過40目篩，取10g粉末，加入乙酸乙酯40mL，靜置提取24h后，過濾除去殘?jiān)瑸V液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干(真空度0.1kPa，溫度30℃)，再用2mL的甲醇重懸，重懸液經(jīng)0.22μm的有機(jī)膜過濾除菌，－20℃保藏，備用[13]。

1.4 報(bào)告菌平板法檢測(cè)(quorum sensing inhibition，QSI)和抑菌實(shí)驗(yàn)

報(bào)告菌CV026過夜活化兩次后，按體積分?jǐn)?shù)2%的比例接種10mL新鮮的LB培養(yǎng)基，120r/min，28℃培養(yǎng)至OD600nm為1.0，與100mL含有40μmol/L的AHL信號(hào)分子C6-HSL和0.8g/100mL瓊脂的LB培養(yǎng)基混合，傾注平板，凝固后，采用平板擴(kuò)散法[14]，每個(gè)濾紙片上點(diǎn)樣5μL粗提物，對(duì)照為5μL甲醇。2 8℃過夜培養(yǎng)。抑菌實(shí)驗(yàn)時(shí)固體培養(yǎng)基中不添加AHL信號(hào)分子，其余同上。

1.5 粗提物對(duì)Escherichia coli 8099生物膜形成的影響

1.5.1 微孔板法

該法參考199 9年O'To ole等[15]提出的方法。Escherichia coli ATCC8099活化兩次后，按體積分?jǐn)?shù)1%接種新鮮的LB培養(yǎng)基，96孔板每個(gè)孔內(nèi)加入的物質(zhì)和量見表1，對(duì)照為甲醇，每個(gè)樣品及對(duì)照做3個(gè)平行樣，37℃培養(yǎng)24h后，移去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用蒸餾水清洗3～ 5次，用125μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的結(jié)晶紫染色15min，用蒸餾水清洗3～5次，去除孔內(nèi)多余的染料，再加入200μL 95%乙醇溶解出結(jié)合于生物膜上的結(jié)晶紫，每個(gè)孔內(nèi)移取125μL到另一96孔板內(nèi)，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(595nm)。

1.5.2 菌落計(jì)數(shù)法

2 結(jié)果與分析

2.1 QSI檢測(cè)和抑菌作用

C. violaceum CV026紫色素的產(chǎn)生受群體感應(yīng)現(xiàn)象的調(diào)控，若樣品提取物中含有QS抑制劑，其將抑制C. violaceum CV026產(chǎn)生紫色，在濾紙片周圍就會(huì)出現(xiàn)白色、渾濁不透明的抑制圈，黑木耳的甲醇粗提物會(huì)產(chǎn)生這種特異性的抑制圈。對(duì)其進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)黑木耳粗提物沒有抑制圈的產(chǎn)生，說明黑木耳的粗提物中有能干擾群體感應(yīng)的物質(zhì)的存在。從圖2可以看出，隨著粗提物質(zhì)量濃度的降低，這種抑制圈的直徑也在隨之減少。對(duì)溶劑甲醇進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其未含有QSI作用和抑菌作用。

圖1 樣品粗提物對(duì)C.violaceumCV026產(chǎn)紫色素的抑制作用Fig.1 Inhibition effect ofAuricularia auricularextract on violacein production

圖2 樣品粗提物對(duì)C.violaceumCV026生長(zhǎng)的抑制作用Fig.2 Inhibition effect ofAuricularia auricularextract onC. violaceumCV026

為了驗(yàn)證樣品粗體物是否對(duì)C. violaceum CV026的生長(zhǎng)有抑制作用，用滅菌后的小棉棒輕觸如圖2的小圓紙片周圍的白色抑制圈，然后點(diǎn)樣在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果見圖3。

因?yàn)楹谀径崛∥锶芙庥诩状贾?，為了測(cè)定黑木耳提取物對(duì)Escherichia coli 8099生物膜形成的影響，甲醇作為陽性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)還做了未添加甲醇和粗提物的對(duì)照。黑木耳粗提物以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/mL的質(zhì)量濃度加入到E. coli 8099培養(yǎng)基中，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，隨著粗提物質(zhì)量濃度的升高，對(duì)生物膜形成的抑制率也逐漸升高，當(dāng)菌液中黑木耳粗提物的質(zhì)量濃度達(dá)到0.6g/mL時(shí)，其對(duì)生物膜形成的抑制率達(dá)到50.23%。微孔板法是一種傳統(tǒng)方法[17-18]，為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)采用了菌落計(jì)數(shù)法。

2.3 菌落計(jì)數(shù)法

該法通過直接計(jì)算生物膜內(nèi)的活菌數(shù)來對(duì)生物膜進(jìn)行量化。甲醇做為對(duì)照，黑木耳粗提物以0.1、0.2、0.3g/mL的質(zhì)量濃度加入到E. coli 8099培養(yǎng)基中，結(jié)果見表2。從圖3可以看出，圖2的小圓紙片周圍確實(shí)生長(zhǎng)有菌落，黑木耳粗體物并沒有抑制C. violaceum CV026的生長(zhǎng)，而只是抑制了紫色桿菌素的產(chǎn)生。

圖3 抑菌實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Fig.3 Verification experiments of antibacterial disk assay

2.2 微孔板法

表1 黑木耳提取物對(duì)生物膜形成的影響(微孔板法)Table 1 Effect of extract fromAuricularia auricularon biofilm formation evaluated by ninety-six-well plate assay

表2 黑木耳提取物對(duì)生物膜形成的影響(菌落計(jì)數(shù)法)Table 2 Effect of extract fromAuricularia auricularon biofilm formation evaluated by colony count assay

從表2可以看出，隨著黑木耳提取物質(zhì)量濃度的提高，其對(duì)E. coli 8099生物膜形成的抑制能力也在逐漸提高。0.3g/mL的粗提物質(zhì)量濃度對(duì)生物膜的抑制率是72.16%。由于PVC小片和96孔板的材料形狀不同，加上操作也不同，所以就同一菌株生物膜實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果有所差異應(yīng)屬正常。

3 討 論

很多腐敗細(xì)菌是通過群體感應(yīng)來調(diào)控腐敗形狀的表達(dá)從而影響食品的品質(zhì)。因此，通過降解或者是失活信號(hào)分子來控制腐敗是目前一個(gè)非常熱點(diǎn)的研究領(lǐng)域。同時(shí)也為食品的防腐保鮮開創(chuàng)了新途徑。這種防腐策略與傳統(tǒng)的防腐技術(shù)不同，它是通過阻斷細(xì)菌細(xì)胞之間的通信，使其不產(chǎn)生腐敗行為，不產(chǎn)生細(xì)菌毒素，但并不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。這種防腐措施不會(huì)導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生，從原來的“肉搏戰(zhàn)”轉(zhuǎn)變?yōu)椤靶畔?zhàn)”。已經(jīng)證明來源于海洋紅藻Delisea pulchra的鹵化呋喃酮化合物10～20μg/mL(此質(zhì)量濃度不會(huì)影響到菌體的生長(zhǎng))通過

與AHL受體蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合而抑制V. fischeri和V. Harveyi的生物發(fā)光現(xiàn)象，抑制率可達(dá)到50～100倍。同時(shí)還以濃度依賴的方式抑制S. liquefaciens的浮游現(xiàn)象。另外，其他的高等植物包括豇豆、番茄、野豌豆、苜蓿和水稻也可分泌QSI，影響細(xì)菌AHL介導(dǎo)的QS調(diào)控系統(tǒng)。但是目前發(fā)現(xiàn)的大部分群體感應(yīng)抑制劑存在一個(gè)問題，它們具有一定的毒性不適于在人類生活中應(yīng)用。比如，鹵代呋喃酮和其衍生物雖有較強(qiáng)的干擾QS信號(hào)通路的活性，卻有一定的誘變致癌作用[19-20]。因此，尋找新的來源的QSI就顯得越來越重要。

本實(shí)驗(yàn)證明黑木耳粗提物可以干擾C.violaceum CV026的群體感應(yīng)現(xiàn)象，但是不影響C. violaceum CV026的生長(zhǎng)。大腸桿菌生物膜的形成也受群體感應(yīng)的調(diào)控，之后又研究了黑木耳提取物對(duì)Escherichia coli 8099生物膜形成的影響。發(fā)現(xiàn)其確實(shí)減弱了生物膜的形成，并且影響程度受黑木耳提取物的質(zhì)量濃度的影響，隨著質(zhì)量濃度的降低，受抑制程度隨之降低。在我國(guó)，黑木耳作為一種食品和藥品已經(jīng)有幾個(gè)世紀(jì)的歷史，黑木耳粗提物或者從中分離到的一些特殊化合物可能被人類用于控制或抑制有害生物膜形成的新型抑制劑。此外，為了能將黑木耳粗提物應(yīng)用于食品領(lǐng)域，其成分以及成分結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步的研究。

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Inhibition Effect of Extract from Auricularia auricular on Quorum Sensing and Biofilm Formation of Bacteria

LI Bin，DONG Ming-sheng*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Methanol-soluble compounds were extracted from Auricularia auricular to investigate the inhibition effect on quorum sensing through agar plate assays. The inhibition effect of extract from Auricularia auricular on biofilm formation of Escherichia coli 8099 was evaluated through ninety-six-well plate biofilm assay and disk reactor biofilm experiments. Approximately 72.16% inhibition rate on biofilm formation was observed in Auricularia auricular extract at the concentration of 0.3 g/mL.

quorum sensing；Auricularia auricular；biofilm；inhibition

TS201.3

A

1002-6630(2010)09-0140-04

2009-12-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30700627)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目(CX(08)113)

李斌(1984—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：binbin27_lee@163.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn