魯振強(qiáng)，陳艷平，馬龍彪，佟清越，陳連江

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校生化與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080）

甜菜轉(zhuǎn)基因體系的相關(guān)影響因素研究

魯振強(qiáng)1，陳艷平1，馬龍彪2，佟清越1，陳連江2

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校生化與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080）

以16種基因型的二倍體甜菜（Beta vulgaris L.）為材料，建立并優(yōu)化了甜菜的植株再生體系；對(duì)影響甜菜轉(zhuǎn)基因的相關(guān)因素進(jìn)行了比較分析，確定了抗生素標(biāo)記基因的適宜篩選濃度為200 mg/L；菌液適宜浸染濃度OD600為0.3；浸染最適時(shí)間為10 min；外植體與農(nóng)桿菌適宜共培養(yǎng)時(shí)間為4 d；添加乙酰丁香酮的適宜濃度為100μmol/L。研究結(jié)果的獲得，為完善甜菜的遺傳工程以及甜菜基因組學(xué)的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

甜菜；轉(zhuǎn)基因；遺傳改良

甜菜（Beta vulgaris L.）為藜科甜菜屬，具有二年生異花授粉習(xí)性，是我國(guó)的主要糖料作物。根據(jù)甜菜的生長(zhǎng)特性和用途可分為糖用、飼用和葉用型甜菜[1］。常規(guī)的甜菜育種主要采取系譜選擇、理化誘變等方法培育新品種，缺點(diǎn)是周期長(zhǎng)，定向選擇性差，效率低。同時(shí)，甜菜基因的高度雜合性，難以建立高效的植株再生體系，不同基因型甜菜之間的再生差別較大，使得其遺傳轉(zhuǎn)化相對(duì)困難。基因工程育種以培養(yǎng)細(xì)胞為基礎(chǔ)，具有目的性強(qiáng)、育種周期短等優(yōu)點(diǎn)，為甜菜新品種的培育提供了新的手段。但是，轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一項(xiàng)新方法，其在甜菜上的研究及應(yīng)用相對(duì)滯后，亟待解決[2,3］。

基于以上的背景以及甜菜基因組學(xué)研究的需求，我們?cè)诤Y選了大量基因型的甜菜后，確定了16種為試材，建立并優(yōu)化了甜菜的植株再生體系；探索了甜菜轉(zhuǎn)基因的相關(guān)影響因素，分別從抗生素標(biāo)記基因的定量選擇，基因、外植體和受體類型的差異影響，預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)等影響因素的篩選，對(duì)甜菜轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化條件和方法進(jìn)行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

16種基因型甜菜（Beta vulgaris L.）種子，由馬龍彪、王華忠老師友情提供，品種名稱分別為：08-1至08-10計(jì)10個(gè)，2B027、2B042、2B049、2B796、2B807、S-08計(jì)6個(gè)，種植于黑龍江大學(xué)溫室及實(shí)驗(yàn)田。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（RifR）和構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pBI121-OsAPX3（CaMV35S啟動(dòng)子，卡那霉素標(biāo)記基因，KanaR），由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 外植體的選擇

選取08-4甜菜無(wú)菌苗的葉柄、葉片、子葉、下胚軸為外植體，分別剪成0.5～1cm長(zhǎng)的小段，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種7～8塊，篩選誘導(dǎo)率較高的外植體。

1.3 主要試劑

常用生化試劑、植物激素、培養(yǎng)基成分均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 轉(zhuǎn)基因體系的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

卡那霉素濃度的設(shè)計(jì)：分別配制含50，100，200，500，1000 mg/L卡那霉素的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，10d為繼代周期，連續(xù)繼代3次后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

農(nóng)桿菌浸染條件：挑取攜帶目的基因的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種在含抗生素的YEP中，180r/min離心后28℃培養(yǎng)18h，至OD600=0.6時(shí)，菌液按1∶10稀釋，取適量菌液于無(wú)菌離心管中，3000 r/min離心5min，棄去上清液，沉淀重懸，調(diào)至OD600=0.2～0.6待用。分別設(shè)計(jì)浸染菌液濃度OD600值分別為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6的5種稀釋菌液中浸染5 min，然后共培養(yǎng)4d，以確定最佳菌液濃度；當(dāng)OD600值為0.3時(shí)，浸染時(shí)間分別為1，5，10，20min，然后共培養(yǎng)4d，以確定最佳浸染時(shí)間；當(dāng)OD600值為0.3，浸染時(shí)間為5 min時(shí)，分別共培養(yǎng)2，4，6，8d，以確定最佳共培養(yǎng)時(shí)間；在OD600值為0.3的菌液中加入乙酰丁香酮（AS）的濃度分別為0，50，100，200μmol/L，浸染時(shí)間為5 min，然后共培養(yǎng)4d，以確定最佳乙酰丁香酮（AS）的加入濃度。

取再生的甜菜抗性單芽并切下，繼而誘導(dǎo)生根，單株栽培并管理，長(zhǎng)成完整植株。

1.5 轉(zhuǎn)基因甜菜的分子檢測(cè)

剪取具有卡那霉素抗性、長(zhǎng)勢(shì)較好的轉(zhuǎn)基因（pBI121-OsAPX3）再生甜菜的幼嫩葉片，提取基因組DNA，以轉(zhuǎn)基因甜菜總DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1μL，10×PCR Buffer 2μL，10mM dNTP Mixture 1.6μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH2O 13.3μL，r Taq 0.1μL。94℃，5min；（94℃，30s；57℃，30s；72℃，1min）×35個(gè)循環(huán)；72℃，10min；4℃結(jié)束。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素濃度的篩選

本研究所使用的植物表達(dá)載體pBI121具有卡那霉素類的抗生素標(biāo)記基因，是篩選轉(zhuǎn)基因甜菜的第一步，其濃度的確定是較重要的。Kana濃度過(guò)高，會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生毒害，以使其在篩選過(guò)程中死亡，從而降低轉(zhuǎn)化效率。而濃度過(guò)低，不能對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行嚴(yán)格的篩選，會(huì)產(chǎn)生假抗性植株，會(huì)增加后續(xù)轉(zhuǎn)化植株鑒定的工作量。因此，合適的Kana濃度既能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，又不影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。所以在轉(zhuǎn)化之前需先確定Kana的用量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1中數(shù)據(jù)可以看出，卡那霉素對(duì)甜菜葉柄的分化和叢生芽塊的存活都有不同程度的影響?？敲顾貙?duì)甜菜生長(zhǎng)的抑制作用，隨著濃度的提高不斷增強(qiáng)。當(dāng)卡那霉素濃度為100 mg/L時(shí)，葉柄分化頻率下降為3%；當(dāng)濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，叢生芽塊的存活率也僅為13%，濃度繼續(xù)增高時(shí)，所有外植體都將枯萎死亡。因此，確定選擇100 mg/L作為轉(zhuǎn)化葉柄外植體的篩選濃度，選擇200 mg/L作轉(zhuǎn)化叢生芽塊的篩選濃度。

2.2 農(nóng)桿菌浸染條件的確定

由農(nóng)桿菌浸染液濃度和外植體染菌率與抗性芽得率的結(jié)果可見(jiàn)，菌液濃度的增加，外植體染菌率也變大，浸染液OD600為0.4、0.5、0.6時(shí)，葉柄邊緣形成較大的菌苔，菌的生長(zhǎng)不易抑制；當(dāng)菌液OD600為0.2、0.3時(shí)，生長(zhǎng)較好，綜合考慮外植體染菌率和抗性芽率，確定OD600為0.3作為適宜浸染菌液濃度。

農(nóng)桿菌浸染甜菜外植體的時(shí)間結(jié)果顯示，20min農(nóng)桿菌生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，在葉柄外形成黃色的大菌落，菌的生長(zhǎng)無(wú)法抑制；浸染時(shí)間為1min和5min時(shí)，農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)均得到了有效的抑制，但是抗性芽得率低；而浸染時(shí)間為10min時(shí)，農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)得到了一定的控制，而且有較高的抗性芽率；考慮到確保農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的成功，確定10min作為適宜浸染時(shí)間。

由共培養(yǎng)天數(shù)對(duì)甜菜葉柄遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果可見(jiàn)，共培養(yǎng)8d時(shí)，染菌率高達(dá)62.7%，嚴(yán)重影響了甜菜外植體的生長(zhǎng)，抗性芽得率僅為1.3%。共培養(yǎng)1d的外植體，染菌率不高，但是抗性芽得率也很低，只有2.7%。經(jīng)過(guò)4d共培養(yǎng)的外植體經(jīng)篩選培養(yǎng)，染菌率不是很高，甜菜抗性芽得率為12.0%。甜菜葉柄外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)4d后進(jìn)行篩選培養(yǎng)獲得的抗性芽最多，效果比較理想。

表1 不同Kana濃度下葉柄不定芽再生率和叢生芽塊存活率

圖1 轉(zhuǎn)OsAPX3基因甜菜的PCR檢測(cè)

2.3 乙酰丁香酮的影響

農(nóng)桿菌菌液中加入乙酰丁香酮對(duì)甜菜葉柄遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響，但影響程度不大，加入量為100μmol/L時(shí)，抗性芽得率為13.5%，不加的時(shí)候，抗性芽得率為10.3%，但是，隨著乙酰丁香酮的增加，甜菜外植體的褐化率不斷升高，當(dāng)乙酰丁香酮濃度為200μmol/L時(shí)，外植體褐化率達(dá)到26.3%。所以，添加100μmol/L乙酰丁香酮為適宜濃度。

2.4 轉(zhuǎn)基因甜菜再生植株的分子鑒定

以提取的轉(zhuǎn)基因甜菜再生植株的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1。初步證明外源基因OsAPX3已導(dǎo)入并整合到甜菜基因組中，對(duì)所獲得的所有抗性植株均進(jìn)行了PCR檢測(cè)，得到PCR陽(yáng)性植株6株。

3 討論

甜菜由于它的高度自交不親和性，常使得優(yōu)良基因型非常容易丟失，常規(guī)育種方法難以解決；甜菜轉(zhuǎn)基因相關(guān)技術(shù)的研究及應(yīng)用相對(duì)滯后，進(jìn)展較緩慢，難以滿足當(dāng)今甜菜遺傳改良的要求[2-4］。本研究正是基于此，建立并優(yōu)化了甜菜的植株再生體系；探索了甜菜轉(zhuǎn)基因的相關(guān)影響因素。結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，甜菜對(duì)卡那霉素的反應(yīng)較其他植物更為不敏感，在200 mg/L卡那霉素的選擇壓力下仍有部分野生型植株存活，這也提醒我們?cè)谖磥?lái)的植物抗性標(biāo)記基因的選擇上，要充分考慮到這一點(diǎn)，加以避免。農(nóng)桿菌與甜菜外植體共培養(yǎng)是整個(gè)甜菜遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中非常重要的環(huán)節(jié)，因?yàn)檗r(nóng)桿菌的附著以及T-DNA的轉(zhuǎn)移與整合都在共培養(yǎng)時(shí)完成，因此共培養(yǎng)時(shí)間的把握是甜菜基因轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。農(nóng)桿菌在轉(zhuǎn)化甜菜時(shí)，它本身并不侵入到植物細(xì)胞中去，而是把目的基因轉(zhuǎn)移到甜菜細(xì)胞中。菌液附著甜菜外植體后并不能立刻轉(zhuǎn)化，只有在甜菜創(chuàng)傷部位生活一定時(shí)間之后的菌株才可以誘發(fā)腫瘤，這一段時(shí)間稱之為調(diào)節(jié)期，因此，農(nóng)桿菌與甜菜外植體共培養(yǎng)時(shí)間不能太短。但是如果共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，就會(huì)使后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中難以抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。

同時(shí)，乙酰丁香酮并非甜菜轉(zhuǎn)基因的必需條件，過(guò)量的添加致使再生組織的褐化更為嚴(yán)重；對(duì)于供試的基因型、外植體類型間的差異，仍是限制當(dāng)前甜菜遺傳轉(zhuǎn)化的很大因素。愈傷組織的誘導(dǎo)可以達(dá)到較高的頻率，但是關(guān)于愈傷組織的細(xì)胞調(diào)控，仍有待進(jìn)一步的深入探索。較為樂(lè)觀的是，預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)等轉(zhuǎn)化條件和方法經(jīng)過(guò)比較研究，已經(jīng)達(dá)到預(yù)期，為后期甜菜的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用以及基因組學(xué)研究，提供了技術(shù)保障。

[1］中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所.中國(guó)甜菜栽培學(xué)[M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1982，81-114.

[2］孫亞卿，邵金旺，張少英.甜菜基因工程研究進(jìn)展及其展望[J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（4）:27-32.

[3］杜昕鈺.轉(zhuǎn)RIPs基因甜菜T1代的遺傳穩(wěn)定性與抗病生理特性鑒定[D］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009:4-6.

[4］李玉萍.基因工程在甜菜育種中的研究現(xiàn)狀[J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（2）:55-57.

Related Impact Factors on Transgene System of Sugarbeet

LU Zhen-qiang1,CHEN Yan-ping1,MA Long-biao2,TONG Qing-yue1,CHEN Lian-jiang2
(1.Key Lab of Biochemistry and Molecular Biology/College of Life Sciences Heilongjiang University,Harbin 150080,China; 2.Key Lab of Crop Genetics and Breeding/Institute for Crop Research,Heilongjiang University,Harbin 150080,China)

Sugarbeet（Beta vulgaris L.）varieties including 16 kinds genotype were chosen,its plant generation system was established and optimized,and related factors on genetic transformation were compared and analyzed as well.In this study,optimal dose of Kanamycin 200 mg/L was identified;optimal infected Agrobacterium tumefaciens EHA105-OsAPX3 was OD600=0.3;and the optimal infected internal was 10min;the optimal explants co-cultured with agrobacterium was 4 days;the optimal concentration of acetosyringone added was 100μmol/L.The results would make full usage ofgenetic transformation and genome on sugarbeetin the future.

Sugarbeet（Beta vulgaris L.）;Gene transformation;Genetic improvement

S566.303；Q78

A

1007-2624（2010）03-0001-03

2010-05-28

中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（20080440918）；黑龍江省博士后基金資助項(xiàng)目（LBH-Z07029）；黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目（11521222）；黑龍江大學(xué)青年基金項(xiàng)目（QL200526）。

魯振強(qiáng)（1968-），男，博士，碩士生導(dǎo)師。主要從事植物基因組研究。Tel:0451-86608243;E-mail:zhenqianglu@163.com

陳連江，研究員，黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院。