新疆粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮的抗氧化活性

古麗巴哈爾·阿巴拜克力

(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

新疆粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮的抗氧化活性

古麗巴哈爾·阿巴拜克力

(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

采用有機(jī)溶劑提取新疆粉綠鐵線蓮植物總黃酮，測(cè)定總黃酮提取液的還原力、抗氧化能力。以VC作對(duì)照，不同部位還原力強(qiáng)弱為：VC＞粉綠鐵線蓮葉＞粉綠鐵線蓮花＞粉綠鐵線蓮果實(shí)＞粉綠鐵線蓮莖。對(duì)于羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力粉綠鐵線蓮葉優(yōu)于其他3個(gè)部位，對(duì)于DPPH自由基的清除率大小依次為粉綠鐵線蓮果實(shí) ＞粉綠鐵線蓮花＞粉綠鐵線蓮葉＞粉綠鐵線蓮莖。因此，粉綠鐵線蓮總黃酮具有一定的抗氧化能力，值得深入研究其生理功能以開發(fā)相應(yīng)的功能產(chǎn)品。

粉綠鐵線蓮；總黃酮；還原力；抗氧化

粉綠鐵線蓮(Clematis glauca Willd.)藤本，生于山地灌叢，海拔1700～2500米，平原河漫灘城郊田間及荒地。分布于我國新疆、青海、甘肅、陜西、山西。國外在蒙古、西伯利亞及中亞地區(qū)也有分布。全草可以入藥，可祛風(fēng)濕，主治慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)疼痛；熬膏外敷可以治療瘡；枝葉水煎外洗，可止瘙癢癥[1]。

自由基是具有不成對(duì)電子的原子或分子，其性質(zhì)不穩(wěn)定，大多富于反應(yīng)活性。近年來，研究自由基及其抑制劑、清除劑和動(dòng)力學(xué)機(jī)制逐漸成為化學(xué)及醫(yī)學(xué)中的一個(gè)新的研究方向，受到人們?cè)絹碓酱蟮年P(guān)注，并取得不少研究成果[2-3]。目前，國內(nèi)外有關(guān)于粉綠鐵線蓮的報(bào)道不多，多集中在其揮發(fā)油、黃酮類化合物提取方面[4]，本實(shí)驗(yàn)研究新疆地產(chǎn)藥用植物粉綠鐵線蓮不同部位中黃酮類化合物的抗氧化活性，旨在為開發(fā)和利用其有效成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粉綠鐵線蓮采自新疆烏魯木齊縣永豐鄉(xiāng)農(nóng)田田埂等地。

蘆丁對(duì)照品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醚、無水乙醇、三氯化鐵、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、DPPH(1,1二苯基苦味?；诫?、VC等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

粉碎機(jī)、2800UV-VIS掃描型紫外可見分光光度計(jì)

上海尤尼柯儀器有限公司；PL-IC電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱、SHZ-D循環(huán)水式真空泵、HH-S電熱恒溫水浴鍋、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.3 黃酮的測(cè)定

1.3.1 試劑制備

體積分?jǐn)?shù)4%過氧化氫水溶液、pH6.8磷酸緩沖液、pH8.2 Tris-HCl緩沖液[5]。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備[6]

準(zhǔn)確稱取蘆丁對(duì)照品(120℃干燥至恒質(zhì)量)0.0200g，加30%乙醇溶解，定容到100mL容量瓶中，搖勻。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取0.200mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別置于25mL容量瓶中，各加5g/100mL亞硝酸鈉水溶液1.0mL，混勻，放置6min；加10g/100mL硝酸鋁水溶液1.0mL，混勻，放置6min；加4g/100mL氫氧化鈉10mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15min。按照分光光度法在510nm波長(zhǎng)處，以試劑空白作參比測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 粉綠鐵線蓮不同部位中總黃酮的提取[7-8]

鐵線蓮樣品不同部位樣品自然風(fēng)干，然后粉碎成末。分別準(zhǔn)確稱取一定量的不同部位粉末，置于索氏提取器中，乙醚于45℃水浴回流脫脂。直到醚層無色為止，棄醚層，揮干乙醚，按料液比1:40的比例用70%乙醇于70℃水浴中連續(xù)提取2h，趁熱過濾。同樣的方法提取兩次，合并兩次提取液。用70%乙醇洗滌樣品粉末(10mL×2)，過濾，將提取液和洗液合并，濃縮提取液。用30%乙醇定容于100mL容量瓶中，備用。

1.3.5 測(cè)定方法

分別量取不同部位樣品液0.4mL，于25mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)中的方法進(jìn)行操作，于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.6 總黃酮含量計(jì)算公式

總黃酮含量/(mg/mL)=稀釋倍數(shù)×c

式中：c為測(cè)定樣品液中蘆丁的含量/(mg/mL)；稀釋倍數(shù)=100mL/0.4mL=62.5；重復(fù)測(cè)定4次，取其平均值。

1.4 還原力的測(cè)定

分別準(zhǔn)確吸取2.0mL不同質(zhì)量濃度的不同部位樣品液、VC溶液，加入0.2mol/L pH6.8磷酸緩沖液2.0mL，1%鐵氰化鉀2.0mL，50℃水浴20min后急速冷卻，加入10g/100mL三氯乙酸水溶液2.0mL，于3000r/min離心10min，取上清液5.0mL，加蒸餾水4.0mL、0.1%三氯化鐵1.0mL，混合10min后以蒸餾水作參比于700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.5 抗氧化性能測(cè)定

1.5.1 測(cè)定粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮對(duì)羥自由基的清除率[9]

式中：A0為空白對(duì)照溶液吸光度；Ax為樣品液吸光度；Ax0不加H2O2樣品液的本底吸光度。

1.5.2 測(cè)定不同部位總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除率[10]

式中：A空為空白管吸光度；A樣為樣品液吸光度。

1.5.3 測(cè)定不同部位總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率[11]

式中：Ac為2.0mL(0.04mg/mL)DPPH＋2.0mL 95%乙醇溶液的吸光度；AI為2.0mL(0.04mg/mL)DPPH＋2.0mL樣品液的 吸光度；AJ為2.0mL(0.04mg/mL)樣品＋ 2.0mL95%乙醇溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

用最小二乘法經(jīng)線性回歸，得回歸方程：y = 0.0968x-0.0224，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9996，表明蘆丁濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2 粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果

表1 粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮的含量(±s，n=4)Table 1 Total flavonoid contents of different organs ofClematis glaucaWilld. (±s，n=4)

表1 粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮的含量(±s，n=4)Table 1 Total flavonoid contents of different organs ofClematis glaucaWilld. (±s，n=4)

部位莖葉花果實(shí)總黃酮含量/(mg/mL)2.766±0.0936 8.5315±0.0806 3.4535±0.3402 2.8285±0.1645

由表2可知，粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮含量有一定的差別，總黃酮含量依次為粉綠鐵線蓮葉＞花＞果實(shí)＞莖。不同質(zhì)量濃度樣品液的制備用30%乙醇稀釋即得。

2.3 粉綠鐵線蓮還原力測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，可以看到4個(gè)部位光密度都隨總黃酮質(zhì)量濃度的增大逐漸增加。經(jīng)SPSS分析，粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮的還原力與質(zhì)量濃度呈線性相關(guān)，其回歸方程分別為：VC：y=0.2299x+0.7333(R2= 0.9818)；葉：y = 0.1195x + 0.1773(R2= 0.9051)；果實(shí)：y = 0.0518x +

0.1386(R2= 0.8318)；花：y= 0.0842x + 0.1432(R2=0.9234)；莖：y=0.040x+ 0.1094(R2= 0.7283)。不同部位總黃酮的還原力都隨著質(zhì)量濃度濃度的增大而增強(qiáng)，其還原能力大小是：VC＞粉綠鐵線蓮葉＞粉綠鐵線蓮花＞粉綠鐵線蓮果實(shí)＞粉綠鐵線蓮莖。光密度越大則還原力越強(qiáng)。總體來看粉綠鐵線蓮葉的還原力要強(qiáng)于粉綠鐵線蓮果實(shí)、花、莖。

圖1 粉綠鐵線蓮不同抗氧化劑的還原力Fig.1 Concentration dependent curves of reducing power of different organs ofClematis glaucaWilld. and VC

2.4 粉綠鐵線蓮對(duì)·OH清除率的測(cè)定結(jié)果

圖2 粉綠鐵線蓮清除·OH活性的量效關(guān)系Fig.2 Concentration dependent curves of hydroxyl free radical scavenging capacity of different organs ofClematis glaucaWilld. and VC

由圖2可知，各樣品對(duì)清除·OH均有較好的量效關(guān)系。在200～1000μg/mL范圍內(nèi)經(jīng)SPSS分析，粉綠鐵線蓮不同部位樣品液及VC的曲線方程分別為：VC：y=13.173x+23.439(R2=0.9932)；葉：y=5.06x+10.01(R2= 0.8836)；果實(shí)：y=4.670x+9.294(R2=0.8750)；花：y= 4.226x+7.634(R2=0.9646)；莖：y=3.774x+6.366(R2= 0.9797)。樣品液質(zhì)量濃度200μg/mL時(shí)莖、葉、果實(shí)總黃酮對(duì)·OH的清除率較接近。葉樣品液質(zhì)量濃度在600～1000μg/mL時(shí)總黃酮對(duì)·OH的清除效率較高。

果實(shí)樣品液總黃酮對(duì)·OH的清除率在樣品質(zhì)量濃度200～400μg/mL時(shí)隨質(zhì)量濃度的變化增加明顯，隨后增加幅度不明顯。莖、花等樣品液總黃酮對(duì)·OH的清除率樣品液在質(zhì)量濃度200～1000μg/mL隨質(zhì)量濃度的增大變化不明顯。比較各個(gè)部位對(duì)·OH清除能力的最高值大小為： VC＞粉綠鐵線蓮葉＞粉綠鐵線蓮果實(shí)＞粉綠鐵線蓮花＞粉綠鐵線蓮莖。

2.5 粉綠鐵線蓮對(duì)O2·清除作用的測(cè)定結(jié)果

圖3 粉綠鐵線蓮清除O2·活性的量效關(guān)系Fig.3 Concentration dependent curves of superoxide anion free radical scavenging capacity of different organs ofClematis glaucaWilld. and VC

由圖3可知，各樣品對(duì)O2·的清除作用都隨質(zhì)量濃度的增大而有不同程度的增強(qiáng)，經(jīng)SPSS分析，粉綠鐵線蓮不同部位樣品液及VC的曲線方程分別為：VC：y=12.878x-1.158(R2=0.9888)；葉：y=6.654x-0.50(R2= 0.7091)；果實(shí)：y=5.992x+5.63(R2=0.9827)；花：y= 3.424x+0.42(R2=0.9961)；莖：y=6.779x-5.905(R2= 0.9884)。VC對(duì)O2·的清除率隨質(zhì)量濃度的增加顯著增強(qiáng)，莖樣品液總黃酮對(duì)O2·的清除率隨著樣品液質(zhì)量濃度增加而緩慢增長(zhǎng)。果實(shí)樣品液質(zhì)量濃度200～600μg/mL時(shí)清除率上升較快，在600～800μg/mL時(shí)清除率變化不明顯，超過 800μg/mL后清除率變化明顯?；悠芬涸跐舛?00～1000μg/mL時(shí)清除率變化較緩慢。葉樣品液對(duì)該自由基清除率隨著質(zhì)量濃度變化在200～800μg/mL時(shí)增加不明顯，但超過 800μg/mL后增加明顯。各部分對(duì)O2·的清除能力的最高值大小為：VC＞粉綠鐵線蓮葉＞粉綠鐵線蓮果實(shí)＞粉綠鐵線蓮莖＞粉綠鐵線蓮花。

2.6 粉綠鐵線蓮對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

圖4 粉綠鐵線蓮清除DPPH自由基活性的量效關(guān)系Fig.4 Concentration dependent curves of DPPH free radical scavenging capacity of different organs ofClematis glaucaWilld. and VC

由圖4可知，經(jīng)SPSS分析，粉綠鐵線蓮不同部位樣品液及VC的曲線方程分別為：VC：y=12.606x+22.606 (R2=0.9268)；葉：y=2.519x+10.477(R2=0.9961)；果實(shí)：

y=1.672x+20.36(R2=0.9272)；花：y=1.453x+17.803(R2= 0.95.3)；莖：y=1.935x+9.617(R2=0.9373)。不同部位自由基清除率隨著樣品液質(zhì)量濃度增加而增加但不明顯，樣品液質(zhì)量濃度200μg/mL時(shí)莖和葉的DPPH自由基清除能力相近，樣品液質(zhì)量濃度600μg/mL時(shí)莖、花、葉、果實(shí)對(duì)DPPH自由基清除能力相近。但可以明顯的看出果實(shí)和花對(duì)DPPH自由基清除能力大于莖和葉的清除率?？偟膩砜矗煌课粚?duì)DPPH自由基清除能力的大小順序?yàn)椋篤C ＞粉綠鐵線蓮果實(shí) ＞粉綠鐵線蓮花＞粉綠鐵線蓮葉＞粉綠鐵線蓮莖。

3 結(jié) 論

粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮具有較強(qiáng)的還原力，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，還原力也增加，5種待測(cè)樣品的還原力強(qiáng)弱為：VC＞粉綠鐵線蓮葉＞粉綠鐵線蓮花＞粉綠鐵線果實(shí)＞粉綠鐵線蓮莖。

實(shí)驗(yàn)證明，粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮具有很強(qiáng)的清除自由基的能力。在高質(zhì)量濃度時(shí)(1000μg/mL)葉對(duì)·OH的清除率高于其他3個(gè)部位，而莖、葉、花相差不大；在1000μg/mL是葉對(duì)O2·清除率也明顯高于其他3個(gè)部位，而其他3個(gè)部位的清除能能力依次為果實(shí)＞莖＞花；對(duì)DPPH自由基的清除率為粉綠鐵線蓮果實(shí)＞花＞葉＞莖。

總體看來，粉綠鐵線蓮總黃酮具有很強(qiáng)的還原能力和自由基清除活性，通過本研究可知粉綠鐵線蓮具有較好的醫(yī)學(xué)價(jià)值。

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Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Different Organs of Clematis glauca Willd. in Xinjiang

Gulibahaer ABABAIKELI
(College of Life Science, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China)

The organic solvent extraction of different organs of Clematis glauca Willd. in Xinjiang was performed for obtaining total flavonoids, and the extract obtained was tested for its reducing power and its abilities to scavenge hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals using VC as the control. The order of reducing power of different organs of Clematis glauca Willd and VC from strong to weak was VC ＞ leaf ＞ flower ＞ fruit ＞ stem. The leaves of Clematis glauca Willd. was superior to the other three organs of the plant in hydroxyl and superoxide anion free radical scavenging capacities. As for the ability to scavenge DPPH free radicals, the four organs of the plant were ranked as follows: fruit ＞ flower ＞ leaf ＞ stem. In a word, the total falavonoids from Clematis glauca Willd. have some antioxidant activity and thus, deserve to be developed as functional products based on in-depth studies of their physiological functions.

Clematis glauca Willd.；total flavonoid；reducing power；antioxidant activity

Q946.8

A

1002-6630(2010)23-0018-04

2010-08-18

新疆瀕危物種保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目

古麗巴哈爾·阿巴拜克力(1969—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)橹参镉行С煞址治?。E-mail：gvlbahar.a@163.com