富硒蛹蟲草抗氧化作用研究

李華為，趙素云，鐵 梅,*

(1.沈陽師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

富硒蛹蟲草抗氧化作用研究

李華為1，趙素云2，鐵 梅2,*

(1.沈陽師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

從富硒蛹蟲草中提取硒多糖和硒蛋白。分別采用ICP-MS法和苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法對(duì)硒多糖和硒蛋白中硒、多糖及蛋白含量進(jìn)行測(cè)定；在Fenton體系中，以510nm波長處的吸光度研究硒多糖和硒蛋白對(duì)羥自由基的清除作用。結(jié)果表明：硒多糖和硒蛋白清除羥自由基的效果強(qiáng)于相同濃度的無機(jī)硒、多糖及蛋白；其中，富硒蛹蟲草硒多糖的對(duì)羥自由基最高清除率為38.02%，而硒蛋白的最高清除率可達(dá)75.00%。

蛹蟲草；硒多糖；硒蛋白；Fenton體系；羥自由基

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris L. Link)又稱北冬蟲夏草，與冬蟲夏草同屬異種。國內(nèi)自上世紀(jì)80年代廣泛開展了蛹蟲草的人工栽培與產(chǎn)品開發(fā)利用，現(xiàn)已能大批量生產(chǎn)。蛹蟲草在提高人體免疫力、抗腫瘤和抗氧化活性等方面是公認(rèn)的藥用真菌，它的主要活性成分是蟲草蛋白和多糖[1-3]。硒是人體必需的限量元素，缺硒會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。對(duì)蛹蟲草進(jìn)行富硒培養(yǎng)以提高其營養(yǎng)和藥用價(jià)值是人們十分關(guān)注的重要課題[4-5]。其中硒蛋白、硒多糖等有機(jī)硒既可作為免疫調(diào)節(jié)劑，又可作為防癌、抗病毒的保健品，在藥學(xué)方面的研究報(bào)道較多，而在抗氧化方面報(bào)道極少。自由基是人體生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物。機(jī)體在代謝過程中或受高能輻射和光分解等作用，都會(huì)刺激產(chǎn)生自由基，造成氧化和抗氧化的不平衡狀態(tài)，引起各種疾病[6-7]。本研究以富硒蛹蟲草為研究對(duì)象，提取其中具有生物活性的硒多糖和硒蛋白進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，以為尋求新的天然抗氧化劑、開發(fā)富硒蛹蟲草的藥用價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

富硒蛹蟲草(自行培養(yǎng))[8]。

硫酸亞鐵、過氧化氫、亞硒酸鈉、鄰二氮菲、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

7500c型電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS) 美國Agilent公司；紫外-可見光譜儀 美國Varian公司；CLJ2000型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 有機(jī)硒化合物的提取及其組分含量的測(cè)定

在最佳浸提條件下提取硒多糖和硒蛋白[9-10]；采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)得多糖和蛋白的含量[11-13]；用ICP-MS法測(cè)定硒多糖和硒蛋白中硒的含量[14-15]。

1.2.2 Fenton體系條件實(shí)驗(yàn)

利用Fenton體系[16-18]測(cè)定有機(jī)硒化合物對(duì)·OH的清除作用。Fe2+和H2O2反應(yīng)產(chǎn)生·OH，由于·OH可特異地使鐵-鄰二氮菲褪色，根據(jù)褪色程度用分光光度計(jì)于510nm波長處測(cè)定吸光度，可計(jì)算·OH含量。

分別改變FeSO4、鄰二氮菲、H2O2濃度及保溫時(shí)間。每改變一種組分濃度時(shí)，體系其他組分濃度不變，并測(cè)定其吸光度作為參比?？疾烀恳环N組分濃度改變對(duì)體系吸光度的改變情況。

1.2.3 有機(jī)硒化合物對(duì)·OH清除作用的測(cè)定

在Fenton體系中分別加入一定濃度不同體積的有機(jī)硒溶液，用去離子水定容至10.0mL。于37℃恒溫水浴中反應(yīng)90min，以5mm比色池測(cè)吸光度A510nm。

式中：A樣品為受試樣品的吸光度；A空白為這體系完全損傷時(shí)的吸光度；A對(duì)照為體系未損傷時(shí)的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖、蛋白及硒含量的測(cè)定結(jié)果

采用苯酚-硫酸法分別對(duì)質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60、70μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液進(jìn)行測(cè)定，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.0057x＋0.004，相關(guān)系數(shù)r＝0.9990，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線所得蛹蟲草硒多糖中多糖的質(zhì)量濃度為524.65μg/mL；采用考馬斯亮藍(lán)染色法分別對(duì)質(zhì)量濃度為20、40、60、80μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液進(jìn)行測(cè)定，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.006x-0.0062，相關(guān)系數(shù)r＝0.9978，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線所得蛹蟲草硒蛋白中蛋白的質(zhì)量濃度為126.17μg/mL；通過ICP-MS法測(cè)得蛹蟲草硒多糖中硒的含量為0.01256μg/mL，硒蛋白中硒的含量為4.84μg/mL。

2.2 Fenton體系實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.2.1 FeSO4、鄰二氮菲及H2O2濃度對(duì)ΔA510nm的影響

圖1 FeSO4濃度對(duì)ΔA510nm的影響Fig.1 Effect of FeSO4concentration on the change of absorbance

由圖1可知，隨著FeSO4濃度的增加(固定H2O2及鄰二氮菲濃度)，ΔA510nm值也隨之變大，當(dāng)Fe2+濃度增至0.6mmol/L時(shí)，ΔA510nm達(dá)到最大。進(jìn)一步增加Fe2+濃度，ΔA510nm反而下降，故本實(shí)驗(yàn)選取Fe2+濃度為0.6mmol/L。

H2O2體積分?jǐn)?shù)和鄰二氮菲濃度對(duì)ΔA510nm的影響均呈正相關(guān)，如圖2、3所示。 因此，選擇鄰二氮菲最終濃度分別為1mmol/L，H2O2最終體積分?jǐn)?shù)為0.01%。

圖2 鄰二氮菲濃度對(duì)ΔA510nm的影響Fig.2 Effect of phenanthroline concentration on the change of absorbance

圖3 過氧化氫體積分?jǐn)?shù)對(duì)ΔA510nm的影響Fig.3 Effect of H2O2concentration on the change of absorbance

2.2.2 保溫時(shí)間與ΔA510nm的關(guān)系

圖4 保溫時(shí)間對(duì)ΔA510nm的影響Fig.4 Effect of heat preservation time on the change of absorbance

由圖4可知，37℃水浴保溫120min時(shí)間內(nèi)，隨著保溫時(shí)間的延長，而ΔA510nm逐漸增大，90min后改變不明顯，所以設(shè)定加熱時(shí)間為90min。

2.3 有機(jī)硒化合物對(duì)羥自由基的清除作用

根據(jù)2.2節(jié)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照1.2.3節(jié)所述方法產(chǎn)生·OH的Fenton體系，分別加入已知硒濃度和蛋白濃

度的硒蛋白、與硒蛋白中硒濃度相同的亞硒酸鈉、與硒蛋白中蛋白濃度相同的蛋白質(zhì)，使得蛋白質(zhì)的濃度或硒的濃度在同一水平；依次加入量為1、3、5mL，測(cè)定體系中硒濃度由低到高變化過程中波長510nm處的吸光度，以同樣的方法對(duì)硒多糖也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 有機(jī)硒化合物對(duì)羥自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of organic selenium compound on hydroxyl free radicals

由圖5可知，無論是A-T組還是B-T組，隨硒濃度的增加，A510nm都在增加，但硒蛋白(硒多糖)的增加比單純無機(jī)硒和普通蛋白(普通多糖)的增加對(duì)A510nm的影響大。對(duì)于同一加入量，兩組中無機(jī)硒和蛋白(多糖)溶液的A510nm無顯著差異，但硒蛋白(硒多糖)的A510nm卻存在顯著差異。對(duì)于從富硒蛹蟲草中提取的兩種含硒生物大分子，隨著硒濃度的增加，硒蛋白A510nm增加的幅度明顯高于硒多糖。

2.4 硒多糖及硒蛋白對(duì)·OH的清除率

圖6 硒多糖、普通多糖及亞硒酸鈉對(duì)·OH的清除率Fig.6 Scavenging rates of Se-polysaccharide, polysaccharide, and Na2SeO3on hydroxyl free radicals

由圖6、7可知，無論是低濃度組還是高濃度組，富硒蛹蟲草中的硒多糖或硒蛋白對(duì)·OH的清除率均顯著高于普通多糖和蛋白以及亞硒酸鈉，最高清除率分別為：硒多糖38.02%、硒蛋白75.00%、富硒增強(qiáng)了多糖或蛋白清除·OH的能力，硒多糖或硒蛋白比無機(jī)硒補(bǔ)劑具有更高的抗氧化作用；此外，在各濃度組中，硒蛋白對(duì)·OH的清除率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通蛋白和亞硒酸鈉對(duì)·OH的清除率之和，說明硒與食用菌蛋白之間在清除自由基方面存在著協(xié)同作用；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于亞硒

酸鈉而言，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)，隨著濃度的增加其清除效果會(huì)基本保持不變甚至有所降低，說明高濃度的亞硒酸鈉抑制了硒對(duì)自由基的清除作用，以亞硒酸鈉形式存在的硒在相同的硒水平下表現(xiàn)出硒的中毒現(xiàn)象。

圖7 硒蛋白、普通蛋白及亞硒酸鈉對(duì)·OH的清除率Fig.7 Scavenging rates of Se-protein, protein, and Na2SeO3on hydroxyl free radicals

2.5 硒多糖與硒蛋白對(duì)·OH清除作用比較

圖8 硒多糖與硒蛋白對(duì)·OH清除作用的比較Fig.8 Comparison on scavenging rates of Se-polysaccharide and Seprotein on hydroxyl free radicals

由圖6、7可知，同一加入量的硒蛋白清除·OH的效果明顯好于硒多糖，將不同含硒量的硒多糖和硒蛋白對(duì)·OH的清除效果比較結(jié)果如圖8所示。欲達(dá)到同樣的清除效果，所需硒蛋白中硒的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于硒多糖中硒的含量，說明富硒蛹蟲草中的硒蛋白對(duì)·OH的清除效果要明顯好于硒多糖。這也表明：在富硒蛹蟲草中與蛋白結(jié)合的硒是主要存在形態(tài)，因此有機(jī)硒水平的高低直接影響著對(duì)自由基的清除效果。

3 結(jié) 論

通過生物富集培育的富硒蛹蟲草含有大量的有機(jī)硒，其主要化學(xué)形態(tài)為硒蛋白和硒多糖，實(shí)驗(yàn)表明：有機(jī)硒蛋白和硒多糖相對(duì)無機(jī)硒具有更好的清除·OH活性，而且在富硒蛹蟲草中硒蛋白比硒多糖的這種活性更強(qiáng)。這些含硒生物大分子化合物作為一種天然無毒高效的自由基清除劑，無論是對(duì)拮抗或抑制體內(nèi)過量自由基的產(chǎn)生，還是增強(qiáng)機(jī)體免疫活性，都是難得的有機(jī)硒源。以金針菇為富硒載體具有廣闊的應(yīng)用前景，為開發(fā)藥食兩用的有機(jī)硒源提供參考。

[1]徐輝碧, 黃開勛, 高中洪. 硒蛋白與硒多糖[J]. 科學(xué), 1997, 49 (5): 22-25.

[2]張文雄, 梁宏, 覃海錯(cuò). 螺旋藻酸性雜多糖的分離純化和分析[J]. 中草藥, 2000, 31(5): 326-328.

[3]劉蘇萌, 王麗娟, 司艷紅. 蛹蟲草基質(zhì)粗多糖提取及抗氧化活性測(cè)定[J]. 食品科技, 2009, 34(7): 179-182.

[4]崔喬, 尚德靜, 鄒霞. 硒多糖的研究進(jìn)展[J]. 中國生化藥物雜志, 2003, 24(3): 155-157.

[5]黃峙, 鄭文杰, 郭寶江. 含硒生物大分子研究進(jìn)展[J]. 海南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2001, 19(2): 169-175.

[6]YEUNG J H, CHIU L C, OOI V E. Effect of polysaccharide peptide (PSP) on glutathione and protection against paracetamol-induced hepatotoxicity in the rat[J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 1994, 16 (10): 723-729.

[7]WEI W S, TAN J Q, GUO F, et al. Effects of Coriolus versicolor polysaccharides on superoxide dismutase activities in mice[J]. Acta Pharmacol Sin, 1996, 17(2): 174-178.

[8]鐵梅, 張崴, 李晶, 等. 蛹蟲草富硒栽培特性的研究[J]. 食用菌, 2005 (4): 38-39.

[9]鄧桂春, 侯松嵋. 富硒蛹蟲草試樣中硒的形態(tài)分析[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2006, 3(3): 26-29.

[10]李華為, 趙素云, 劉曉波, 等. 硒多糖的抗氧化活性及與過氧化氫酶協(xié)同作用的研究[J]. 分析化學(xué), 2010, 38(9): 1256-1260.

[11]陳曉梅, 劉雅文. 考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性觀察[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2006, 22(3): 380-381.

[12]李曉暉, 李書平, 何云慶. 靈芝多糖的含量測(cè)定研究[J]. 中草藥, 1997, 28(9): 530-531.

[13]董群, 鄭麗伊, 方積年. 改良的苯酚-硫酸法測(cè)定多糖和寡糖含量的研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 1996(9): 550-552.

[14]鐵梅, 臧樹良, 方禹之. SE-HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)在富硒蛹蟲草硒蛋白形態(tài)分析中的應(yīng)用研究[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2006, 27(7): 1232-1236.

[15]鐵梅, 李闖, 費(fèi)金巖. 體積排阻色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在富硒金針菇硒多糖形態(tài)分析中的應(yīng)用研究[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2007(5): 23-26.

[16]陳海霞, 謝筆鈞. 富硒茶葉中茶多糖的某些化學(xué)性質(zhì)及對(duì)羥自由基的清除作用[J]. 衛(wèi)生研究, 2001, 30(1): 58-59.

[17]金鳴, 蔡亞欣, 李金榮. 鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2/F2+產(chǎn)生的羥自由基[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1996, 23(6): 553-555.

[18]沈齊英, 沈秋英. 北蟲草抗氧自由基和羥自由基作用的研究[J]. 廣西植物, 2001(3): 252 -254.

Antioxidant Activity of Selenium-rich Cordyceps militaris

LI Hua-wei1，ZHAO Su-yun2，TIE Mei2,*
(1. College of Chemistry and Life Sciences, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China；2. School of Environmental Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

In this study, selenium polysaccharide and selenium protein were extracted from selenium-rich Cordyceps militaris by modern separation techniques. The contents of selenium, polysaccharide and protein in Se-polysaccharide and Se-protein were determined by ICP-MS, phenol-sulfuric acid method and Coomassie brilliant blue method. In addition, the scavenging capabilities of Se-polysaccharide and Se-protein on hydroxyl free radicals were evaluated by the absorbance at 510 nm in Fenton system. Results indicated that the scavenging activities of Se-polysaccharide and Se-protein were obvious higher than those of inorganic selenium, polysaccharide and protein under the same condition. The highest scavenging rates of Se-polysaccharide and Seprotein were 38.02% and 75.00%, respectively.

Cordyceps militaris；Se-polysaccharide；Se-protein；Fenton system；hydroxyl free radical

S567.3

A

1002-6630(2010)23-0061-04

2010-09-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671176)；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(2008227)

李華為(1962—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：lhw62515@126.com

*通信作者：鐵梅(1964—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊挥袡C(jī)食品生物化學(xué)。E-mail：tiemei07@yahoo.cn