許振偉，許 鐘，楊憲時(shí),*，郭全友，李學(xué)英

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

大黃魚中復(fù)合腐敗菌腐敗能力的分析

許振偉1,2，許 鐘1，楊憲時(shí)1,*，郭全友1，李學(xué)英1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

通過(guò)分析接種腐敗菌的大黃魚無(wú)菌魚塊在貯藏中的感官、腐敗代謝產(chǎn)物和腐敗菌的變化，以腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)和腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)為指標(biāo)，探討冷藏大黃魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌(腐敗希瓦氏菌、假單胞菌以及這兩種菌的復(fù)合菌)的腐敗能力。結(jié)果表明，接種腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復(fù)合菌的無(wú)菌魚塊的貨架期分別為168、174、168h，說(shuō)明接種假單胞菌的貨架期較長(zhǎng)。腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復(fù)合菌的YTVB-N/CFU基本一致，腐敗希瓦氏菌的YTMA/CFU明顯大于假單胞菌和復(fù)合菌，腐敗希瓦氏菌的腐敗能力較假單胞菌和復(fù)合菌強(qiáng)。假單胞菌對(duì)腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)有一定的拮抗作用，但僅在較高數(shù)量時(shí)才有明顯作用，腐敗希瓦氏菌是有氧冷藏養(yǎng)殖大黃魚的特定腐敗菌。

大黃魚；優(yōu)勢(shì)腐敗菌；腐敗能力；腐敗希瓦氏菌；假單胞菌

微生物活動(dòng)是引起鮮魚腐敗變質(zhì)的主要原因，已有研究表明，魚體所含微生物中只有部分參與腐敗過(guò)程，這些適合生存和繁殖并產(chǎn)生強(qiáng)烈異臭味腐敗代謝產(chǎn)物的微生物，就是該魚的特定腐敗菌(specific spoilage organisms，SSO)[1]。特定腐敗菌比其他微生物生長(zhǎng)快，并且腐敗能力強(qiáng)[2]，因此可采用抑制或降低特定腐敗菌生長(zhǎng)的處理和加工方法，即使不影響其他微生物群落，也會(huì)延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期[3]，這為開發(fā)魚類保鮮技術(shù)提供了

新的思路。

郭全友等[4]對(duì)冷藏東海暖水海域養(yǎng)殖大黃魚進(jìn)行研究，貨架期終點(diǎn)時(shí)腐敗希瓦氏菌比例達(dá)86%，其次是假單胞菌，表明腐敗希瓦氏菌和假單胞菌是低溫貯藏大黃魚的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。李學(xué)英等[5]對(duì)大黃魚腐敗希瓦氏菌腐敗能力進(jìn)行了初步分析，表明腐敗希瓦氏菌具有很強(qiáng)的腐敗潛力，但腐敗活性低，需要較高濃度才能引起腐敗。魚類特定腐敗菌的鑒別必須分析比較優(yōu)勢(shì)腐敗菌的腐敗能力。本實(shí)驗(yàn)將有氧冷藏大黃魚在貨架期終點(diǎn)分離、純化、鑒定得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗希瓦氏菌和假單胞菌，分別接種到無(wú)菌魚塊中，比較這兩種菌單一的腐敗能力，并將這兩種腐敗菌按比例混合，分析對(duì)無(wú)菌魚塊的腐敗能力，探討兩種優(yōu)勢(shì)腐敗菌在參與腐敗的過(guò)程中是拮抗、協(xié)同或是共生作用[6]，旨在分析復(fù)合菌大黃魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌的腐敗能力，為魚類特定腐敗菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活大黃魚購(gòu)于上海銅川路水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，個(gè)體大小600～700g/尾，充氧?；钸\(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。立即冰水休克致死，用自來(lái)水沖洗魚體，去頭、去鱗、去內(nèi)臟、去鰭，清洗干凈，用于制備無(wú)菌魚塊。

半微量定氮儀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；721型分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；Sanyo MIR 553低溫培養(yǎng)箱 日本三洋電器集團(tuán)；DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；SEX-TJ凈化工作臺(tái)上海整新電子設(shè)備公司；L550/L530低速臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

CM 559假單胞菌專用培養(yǎng)基(supplemented with SR 103) 英國(guó)OXOID Basingstoke公司；鐵瓊脂培養(yǎng)基 上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 無(wú)菌魚塊的制備

根據(jù)Herbert等[7]的方法，無(wú)菌操作制備無(wú)菌魚塊。

1.4 純菌液的制備與接種貯藏實(shí)驗(yàn)

1.4.1 接種純菌液的制備

挑取實(shí)驗(yàn)室保存的有氧冷藏大黃魚貨架期終點(diǎn)分離、純化、鑒定得到的腐敗希瓦氏菌(S h e w a n e l l a putrefaciens)和熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)純菌株，制備腐敗希瓦氏菌和假單胞菌純菌液[5]。

1.4.2 接種與貯藏實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[5]中的接種方法，進(jìn)行純菌液的接種與接種后的貯藏實(shí)驗(yàn)。其中復(fù)合菌以腐敗希瓦氏菌和假單胞菌菌液體積比1:1接種。取濃度為108CFU/mL的各菌液5mL，加入45mL滅菌生理鹽水中，將該50mL菌液加入450mL滅菌生理鹽水中，即稀釋至106CFU/mL，將兩種菌液以1:1比例混勻用于接種。

將接種后的魚塊置于滅菌的瓷盤中，覆蓋有漏氣孔保鮮膜，放于高精度低溫培養(yǎng)箱中，控制貯藏溫度(5±0.1)℃。每隔6h或12h對(duì)接種的魚塊進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)測(cè)定、三甲胺(trimethylamine，TMA)測(cè)定和腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和兩者的復(fù)合菌菌落計(jì)數(shù)。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 感官評(píng)價(jià)

由6名經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的評(píng)價(jià)員組成感官評(píng)價(jià)小組，采用3分法對(duì)貯藏過(guò)程的接種魚塊進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，0分為最好品質(zhì)，1分為魚塊的鮮香味消失，為高品質(zhì)期(h i g h quality life，HQL)終點(diǎn)；2分為明顯出現(xiàn)異臭味，為貨架期(shelf life，SL)終點(diǎn)即感官拒絕點(diǎn)[8]。

1.5.2 TVB-N測(cè)定

參照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中半微量定氮法測(cè)定。

1.5.3 TMA測(cè)定

參照GB/T 5009.179—2003《火腿中三甲胺氮的測(cè)定》和許龍福等[9]的修訂方法，采用苦味酸法測(cè)定。

1.5.4 細(xì)菌計(jì)數(shù)與培養(yǎng)基

稱取打碎魚肉25g，加入225mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%蛋白胨無(wú)菌生理鹽水，高速振蕩，以10倍梯度稀釋后，取合適濃度稀釋液0.1mL，涂布于培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋液做兩個(gè)平行。

復(fù)合菌：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，25℃有氧培養(yǎng)24h，全部菌落計(jì)數(shù)。腐敗希瓦氏菌：鐵瓊脂培養(yǎng)基，25℃有氧培養(yǎng)24h，黑色菌落計(jì)數(shù)。假單胞菌：假單胞菌專用培養(yǎng)基，25℃有氧培養(yǎng)24h，全部菌落計(jì)數(shù)。

1.6 微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

用修正的Gompertz方程[10]描述微生物的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。修正的Gompertz方程如下所示：

式中：N(t)為t時(shí)間的腐敗菌數(shù)量/(CFU/g)；N、Nmax為初始菌數(shù)和最大菌落數(shù)/(CFU/g)；μmax為最大比生長(zhǎng)速率/h-1；Lag為延滯時(shí)間/h；t為時(shí)間/h。

1.7 腐敗能力的定量分析

以單位腐敗菌產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物，作為腐敗能力的定量指標(biāo)，腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)如下所示[5]：

式中：產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU/(mg TVB-N/CFU)；YTMA/CFU/ (mg TMA/CFU)；N0為初始菌落數(shù)/(CFU/g)；NS為貨架期終點(diǎn)時(shí)的腐敗菌落數(shù)即最小腐敗菌落數(shù)/(CFU/g)；(TVB-N)0、(TVB-N)S為初始點(diǎn)和貨架期終點(diǎn)時(shí)的TVB-N量/(mg/100g)；(TMA)0、(TMA)S為初始點(diǎn)和貨架期終點(diǎn)時(shí)的TMA量/(mg/100g)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

感官評(píng)價(jià)和TVB-N、TMA的變化用Microsoft Exc e l進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，腐敗菌生長(zhǎng)采用修正的Gompertz方程描述，用Statistica 6.5進(jìn)行非線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏中的感官變化

圖1 接種腐敗菌的無(wú)菌魚塊在5℃貯藏的感官變化Fig.1 Sensory quality change of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

由圖1可知，接種腐敗希瓦氏菌、假單胞菌、復(fù)合菌的魚塊分別在84、96、96h達(dá)到高品質(zhì)期終點(diǎn)，分別在168、174、168h達(dá)到感官拒絕點(diǎn)。

2.2 貯藏中TVB-N的變化

圖2 接種腐敗菌的無(wú)菌魚塊在5℃貯藏TVB-N的變化Fig.2 Total volatile base nitrogen change of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

由圖2可知，接種腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復(fù)合菌的魚塊初始TVB-N值分別為8.71、8.81、8.55mg/100g。貯藏初期TVB-N值變化不明顯，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N值增加明顯。在120h前，三者的TVB-N值較接近，曲線變化基本一致，150h后接種腐敗希瓦氏菌和假單胞菌魚塊的TVB-N值明顯高于接種復(fù)合菌的TVB-N值。

2.3 貯藏中TMA的變化

圖3 接種腐敗菌的無(wú)菌魚塊在5℃貯藏TMA的變化Fig.3 Trimethylamine change in sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

由圖3可知，在貯藏初期TMA值幾乎接近于零，60h后接種腐敗希瓦氏菌和接種復(fù)合菌的魚塊TMA值隨著貯藏時(shí)間開始快速增加，其中接種腐敗希瓦氏菌魚塊的TMA值高于接種復(fù)合菌的TMA值；而接種假單胞菌魚塊的TMA值明顯較低，腐敗終點(diǎn)時(shí)TMA含量也很低。

2.4 貯藏中腐敗菌菌落數(shù)的變化

圖4 接種腐敗菌的無(wú)菌魚塊在5℃貯藏腐敗菌菌落數(shù)的變化Fig. 4 Microbial counts change of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

采用修正Gompertz方程描述接種腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復(fù)合菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)是典型的S型曲線，所得回歸相關(guān)系數(shù)值均較高(R2分別為0.990、0.984、0.990)。由圖4可知，假單胞菌和復(fù)合菌的延滯時(shí)間較接近，二者明顯比腐敗希瓦氏菌的延滯時(shí)間短，這與李學(xué)英等[5]的研究相符。在貯藏初期魚塊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，腐敗希

瓦氏菌和假單胞菌的生長(zhǎng)互不影響，此時(shí)屬于微生物生長(zhǎng)中的共生作用，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)和魚塊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷被消耗，兩種腐敗菌的生長(zhǎng)出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)作用，假單胞菌對(duì)腐敗希瓦氏菌有一定的抑制作用，但抑制作用不明顯。

2.5 腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表1 無(wú)菌魚塊5℃貯藏腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Microbial growth kinetic parameters of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

表1是腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通過(guò)比較可知，腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復(fù)合菌的最大腐敗菌數(shù)(Nmax)都大于最小腐敗菌數(shù)(Ns)，表明三者都能引起大黃魚的腐敗。三者的最大比生長(zhǎng)速率(μmax)分別為0.0927、0.0631h-1和0.0516h-1，其中腐敗希瓦氏菌的最大比生長(zhǎng)速率明顯大于假單胞菌和復(fù)合菌，假單胞菌與復(fù)合菌的最大比生長(zhǎng)率基本相一致。三者的延滯時(shí)間分別為41.1、21.1、15.2h，假單胞菌和復(fù)合菌的生長(zhǎng)延滯時(shí)間明顯較腐敗希瓦氏菌短。

2.6 腐敗菌腐敗能力的定量分析

表2 接種腐敗菌的無(wú)菌魚塊在5℃貯藏腐敗菌的產(chǎn)量因子Table 2 Yield factors of TVBN and TMA production of spoilage bacteria inoculated sterile fish blocks stored at 5 ℃

由表2可知，三者的YTVB-N/CFU基本一致，腐敗希瓦氏菌的YTMA/CFU明顯大于假單胞菌的。通過(guò)比較接種腐敗菌的無(wú)菌魚塊貯藏初始點(diǎn)和出現(xiàn)明顯腐臭味時(shí)的感官評(píng)價(jià)、TVB-N、TMA值和腐敗菌數(shù)，腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)、腐敗代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)，大黃魚有氧低溫貯藏的兩種優(yōu)勢(shì)腐敗菌中腐敗希瓦氏菌的腐敗能力較假單胞菌強(qiáng)、復(fù)合菌強(qiáng)。

3 討 論

TMAO(trimethylamine oxide，氧化三甲胺)廣泛分布于海產(chǎn)硬骨魚類的肌肉中，是海產(chǎn)硬骨魚類具有的一種特殊鮮味物質(zhì)。海水魚每100g魚肉組織中含1～100mg TMAO，而淡水魚肉一般僅含有5～20mg TMAO[11]。腐敗希瓦氏菌能將TMAO還原為TMA，而假單胞菌不能或還原TMAO能力非常弱[12]。Miller等[13]將熒光假單胞菌接種到無(wú)菌美洲平鲉魚塊中，腐敗點(diǎn)時(shí)測(cè)得TMA含量?jī)H為0.5mg/100g。本研究中接種假單胞菌的魚塊測(cè)定的TMA含量也很低，腐敗點(diǎn)時(shí)含量?jī)H為1.16mg/100g。

無(wú)菌魚塊可作為腐敗菌腐敗能力研究的基質(zhì)，但無(wú)菌魚塊的無(wú)菌是相對(duì)而言的，無(wú)菌魚塊制備后菌落總數(shù)應(yīng)小于102CFU/g[7]。Gram等[14]研究尼羅河新鮮和腐敗著的鱸魚細(xì)菌學(xué)時(shí)，將細(xì)菌接種到殺菌過(guò)的鱸魚和殺菌過(guò)的鱈魚肉湯中，通過(guò)其腐敗氣味，以確定其腐敗能力，用T M A O培養(yǎng)基來(lái)測(cè)試產(chǎn)生T M A和H2S的能力。Dalgaard[15]研究了包裝鱈魚的特定腐敗菌，得出磷發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)的產(chǎn)量因子(YTMA/CFU)明顯大于腐敗希瓦氏菌的產(chǎn)量因子，磷發(fā)光桿菌是包裝鱈魚的特定腐敗菌。

郭全友等[16]對(duì)養(yǎng)殖大黃魚低溫有氧貯藏貨架期終點(diǎn)的腐敗菌進(jìn)行鑒定，假單胞菌和腐敗希瓦氏菌是有氧冷藏海水魚的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。假單胞菌在海水魚的腐敗中沒(méi)有很大的重要性，這可能是由于其數(shù)量相對(duì)較少，同高數(shù)量的腐敗希瓦氏菌競(jìng)爭(zhēng)能力低[17]。Gram等[18]研究了熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌在鱸魚魚塊中的相互作用，得出熒光假單胞菌會(huì)抑制腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)，但這一相互作用僅在含較高濃度時(shí)才會(huì)影響腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)。這與本研究的接種腐敗希瓦氏菌和假單胞菌兩種腐敗菌的復(fù)合菌的生長(zhǎng)相一致，腐敗希瓦氏菌是冷藏大黃魚的特定腐敗菌，其腐敗能力強(qiáng)。

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Analysis of Spoilage Ability of Single and Mixed Spoilage Bacteria in Pseudosciaena crocea

XU Zhen-wei1,2，XU Zhong1，YANG Xian-shi1,*，GUO Quan-you1，LI Xue-ying1
(1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China；2. College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Sensory quality, metabolic products of spoilage bacteria and change of spoilage bacteria were assayed on sterile Pseudosciaena crocea tissue blocks inoculated with spoilage bacteria, with YTVB-N/CFU and YTMA/CFU, the growth kinetic parameters of the spoilage bacteria and the yield factor of microbial metabolites, respectively, used as the index. Spoilage ability of two spoilage bacteria Shewanella putrefaciens and Pseudomonas spp., as well as the mixing of the two spoilage bacteria were analyzed on Pseudosciaena crocea stored aerobically at chilled condition. The results showed that shelf life was 168 h, 174 h, and 168 h, respectively, for sterile tissue blocks inoculated with Shewanella putrefaciens, Pseudomonas spp. and their mixture, while it was relatively longer with Pseudomonas spp. The YTVB-N/CFUfor Shewanella putrefaciens, Pseudomonas spp. and mixed bacteria was basically similar, meanwhile YTMA/CFUfor Shewanella putrefaciens was higher than for Pseudomonas spp. and mixed bacteria. The spoilage ability of Shewanella putrefaciens was more significant than Pseudomonas spp. and mixed bacteria. Pseudomonas spp. had inhibitory effect on he growth of Shewanella putrefaciens to some extent, however it was not significant until it reached high counts. Shewanella putrefaciens was specific spoilage organism in Pseudosciaena crocea stored at chilled temperature aerobically.

Pseudosciaena crocea；dominant spoilage bacteria；spoilage ability；Shewanella putrefaciens；Pseudomonas spp.

S983

A

1002-6630(2010)23-0118-05

2010-03-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771675)；科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2007GB23260281)；科技部中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) (2007M05)

許振偉(1986—)，男，碩士研究生，主要從事食品微生物安全與質(zhì)量控制研究。E-mail：xuzhenweixu@163.com

*通信作者：楊憲時(shí)(1954—)，男，研究員，本科，主要從事水產(chǎn)品貯藏加工與品質(zhì)控制研究。E-mail：xianshiyang@126.com