小麥秸稈水解糖發(fā)酵制備L-乳酸工藝優(yōu)化

李興江，楊為華，姜紹通，潘麗軍

(1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽豐原集團，安徽 蚌埠 233010)

小麥秸稈水解糖發(fā)酵制備L-乳酸工藝優(yōu)化

李興江1，楊為華2，姜紹通1，潘麗軍1

(1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽豐原集團，安徽 蚌埠 233010)

以秸稈水解液為原料發(fā)酵制備高光學純度L-乳酸將有效提升農業(yè)廢棄物的利用價值?；诎l(fā)酵過程中存在代謝抑制的現(xiàn)象，通過正交試驗與神經(jīng)網(wǎng)絡分析方法，進行秸稈液糖質量濃度優(yōu)化以及活性炭與大孔樹脂對秸稈液抑制的脫除研究，并結合菌株好氧特性進行搖瓶轉速的優(yōu)化。正交試驗表明：秸稈糖質量濃度、活性炭添加量、大孔樹脂含量及搖瓶轉速4個因素對米根霉發(fā)酵秸稈糖制備L-乳酸均具有顯著影響，在正交試驗組中最佳實驗結果為L-乳酸產(chǎn)量為82.8g/L。BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測秸稈糖質量濃度為126g/L、活性炭添加量為2.48g/L、大孔樹脂含量為1.6g/L及500mL搖瓶轉速為234r/min時發(fā)酵最佳，該條件下驗證實驗L-乳酸產(chǎn)量為86.9 g/L。通過正交試驗及神經(jīng)網(wǎng)絡預測分析提高了米根霉發(fā)酵秸稈液制備L-乳酸的產(chǎn)量。

小麥秸稈水解液；米根霉；L-乳酸；正交設計；BP神經(jīng)網(wǎng)絡

我國每年浪費的農作物秸稈超過7億t，若能利用生物發(fā)酵的方法將秸稈降解為水解糖，并進一步轉化成具有更高價值的L-乳酸或其他產(chǎn)物，其產(chǎn)業(yè)前景將非常廣闊[1-3]。

L-乳酸廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料、化工等領域。L-乳酸的聚合物——聚L-乳酸(PLA)是無毒高分子化合物，具有生物相容性，聚L-乳酸是良好的綠色材料，對消除“白色污染”具有極其重要的意義[4-6]。在眾多的產(chǎn)乳酸微生物中，米根霉由于具有產(chǎn)物光學純度高、營養(yǎng)消耗簡單、產(chǎn)物易于分離等特點而成為生產(chǎn)高光學純度L-乳酸的理想菌株，但是秸稈水解糖中大量抑制劑的存在使得菌株的生產(chǎn)能力遠遠低于淀粉糖的發(fā)酵，利用米根霉發(fā)酵秸稈水解液制備L-乳酸的產(chǎn)量距離工業(yè)放大仍有較大距離[7-9]。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡因具有良好的非線性映射而廣泛應用于各種工藝及條件的模型分析中，由于BP神經(jīng)網(wǎng)絡是基于生物神經(jīng)元的相互作用而建立的方法，當其應用于以大量細胞為活動主體的微生物發(fā)酵中時，表現(xiàn)出較高的

適應能力與預測能力[10-11]。標準的BP網(wǎng)絡模型由輸入層、隱含層及輸出層構成，各層次之間的神經(jīng)元通過權重形成全互連接，采用誤差反饋學習算法[12]。

本研究以農作物秸稈水解液為碳源發(fā)酵L-乳酸，通過對發(fā)酵工藝進行正交設計及神經(jīng)網(wǎng)絡分析研究，擬降低發(fā)酵抑制并最終實現(xiàn)秸稈水解液高產(chǎn)L-乳酸。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

菌株：米根霉(Rhizopus oryzae抗抑制劑突變株)為本實驗室保藏。

秸稈糖原料為安徽豐原生化集團國家發(fā)酵工程中心提供，采用160℃、25s瞬時堿爆制備獲得，其中葡萄糖與木糖比例為3.5:1，總糖質量濃度采用旋轉蒸發(fā)制備成90～150g/L。

DM11型大孔樹脂 安徽三星樹脂有限公司；HNY13型活性炭 唐山華能科技炭業(yè)有限公司。

Waters2000型高效液相色譜；756型分光光度計。1.2基本發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)

秸稈水解總糖90g/L、(NH4)2SO42g/L、KH2PO40.8g/L、ZnSO40.44g/L、CaCO340g/L(用于中和菌體所產(chǎn)的酸，保持pH值中性，并采用分消后添加方式)。采用500mL規(guī)模的三角瓶裝液150mL進行發(fā)酵。同時往發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量活性炭與大孔樹脂用于吸附抑制劑，吸附劑滅菌前置入搖瓶內，培養(yǎng)期間保持在培養(yǎng)基內。培養(yǎng)溫度為3 2℃。

1.3 發(fā)酵液中糖及苯類物質的檢測

HPLC檢測，色譜柱為ZORBAX Carbohydrate (4.6mm×150mm，5μm)，檢測器為視差檢測器，進樣量為5μL，室溫條件，流動相為75%乙腈，流速為1.000mL/min。

1.4 發(fā)酵液中糠醛檢測

采用分光光度計檢測[13]。

1.5 L-乳酸檢測方法

HPCE檢測，毛細管內徑75μm，外徑375μm，有效長度50cm，以500mmol/L H3PO4及0.5mmol/L CTAB為運行電解質，電壓9kV，運行時間20min，柱溫20℃，檢測波長210nm。

1.6 正交試驗設計

表1 發(fā)酵工藝正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

以秸稈糖質量濃度、活性炭添加量、大孔樹脂含量及搖瓶轉速4個因素為自變量，分別編碼為A、B、C、D，各個因素分別設置為1、2、3、4四個變量，設計的L16(45)正交試驗因素水平見表1。

1.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型

在對正交試驗分析的基礎上，進行BP神經(jīng)網(wǎng)絡的建模與分析。試驗模型的3層拓撲結構為4-13-1，輸入層到隱含層的a1采用Tansig作為訓練函數(shù)，隱含層到輸出層的a2采用Purelin作為傳遞函數(shù)。輸入對應秸稈糖質量濃度(g/L)、活性炭添加量(g/L)、樹脂添加量(g/L)及生搖瓶轉速(r/min)，并進行歸一化處理，輸出Y對應為L-乳酸產(chǎn)量(g/L)。其中權值參數(shù)IW11是13×4矩陣，權值參數(shù)LW21是1×13矩陣，三層神經(jīng)網(wǎng)絡示意圖見圖1。

圖1 三層神經(jīng)網(wǎng)絡示意圖Fig.1 Schematic diagram of a three- layer neural network

2 結果與分析

2.1 基礎實驗

圖2 活性炭添加量對糠醛吸附影響Fig.2 Effect of activated carbon amount on adsorption of furfurol

圖3 大孔樹脂添加量對苯類物質吸附影響Fig.3 Effect of macroporous resin amount on adsorption of benzenes

在基本培養(yǎng)基的基礎上，發(fā)現(xiàn)底物質量濃度過高明顯產(chǎn)生抑制，進行的單因素試驗條件的初步研究表明，添加一定活性炭與大孔樹脂能夠對水解液中的糠醛、苯類等抑制劑具有明顯吸附作用，從而降低發(fā)酵的抑制。由圖2可知，當活性炭添加量達到3g/L時，糠醛吸附吸附率超過80%，效果明顯。由圖3可知，添加大孔樹脂能夠在一定程度上吸附苯類物質，但是過高的添加量效果并不理想。

2.2 正交試驗結果分析

表2 正交試驗發(fā)酵結果Table 2 Orthogonal array design layout and experimental results

試驗號因素L-乳酸產(chǎn)量Y/(g/L) ABCDE 11111146.1 21222253.6 31333368.4 41444463.5 52123469.8 62214370.5 72341272.6 82432175.7 93134281.1 103243182.5 113312476.4 123421373.9 134142355.4 144231453.9 154324164.9 164413255.5 K157.900 63.10062.12561.625 67.300 K272.150 65.12565.55065.275 65.700 K378.475 70.57569.77569.050 67.050 K457.425 67.15068.50070.000 65.900 R21.050 7.4757.6508.3751.600

在抑制劑吸附研究基礎上，結合菌體好氧特性。選取表1的四因素進行正交試驗。由表2可知，正交試驗最優(yōu)組合為A3B2C4D3，其產(chǎn)酸為82.5g/L，通過極差分析表明，最優(yōu)試驗設計是A3B3C3D4，進一步實施驗證實驗，發(fā)現(xiàn)A3B3C3D4條件下發(fā)酵產(chǎn)酸達82.8g/L，與A3B2C4D3條件下的L-乳酸產(chǎn)量相近。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis for the results from the orthogonal array design

由表3方差結果分析可知，4個因素對產(chǎn)酸影響都顯著。因此，開展進一步的神經(jīng)網(wǎng)絡仿真與模擬研究，以期精確預測最佳發(fā)酵條件并高產(chǎn)L-乳酸。

2.3 神經(jīng)網(wǎng)絡仿真與預測

在正交試驗的基礎上，對菌株的發(fā)酵工藝進行神經(jīng)網(wǎng)絡訓練及仿真。按照圖1的神經(jīng)網(wǎng)絡示意圖，編寫如下程序：

P0=[1,1,1,1;1,2,2,2;1,3,3,3;1,4,4,4;2,1,2,3;2,2,1,4;2,3,4,1;2, 4,3,2;3,1,3,4;3,2,4,3;3,3,1,2;3,4,2,1;4,1,4,2;4,2,3,1;4,3,2,4;4,4,1, 3];%輸入樣本

P=P0'; %輸入樣本的轉置陣

T=[46.1 53.6 68.4 63.5 69.8 70.5 72.6 75.7 81.1 82.5 76.4 73.9 55.4 53.9 64.9 55.5]; %輸出樣本

T_test=[46.1 53.6 68.4 63.5 69.8 70.5 72.6 75.7 81.1 82.5 76.4 73.9 55.4 53.9 64.9 55.5]; %預測樣本真實值

[Pn,minP,maxP,tn,minT,maxT]=premnmx(P,T); %歸一化處理

[S0,Q]=size(P);%輸入層神經(jīng)元為4

S1=13; %隱含層經(jīng)元為13

S2=1; %輸出層經(jīng)元為1

net=newff(minmax(P),[S1,S2],{'tansig','purelin'}, 'trainlm'); %新建BP神經(jīng)網(wǎng)絡并訓練

net.trainParam.epochs=1000; %bp最大訓練次數(shù)為1000

net.trainParam.goal=0.1; %訓練目標為0.1

net.trainParam.mc =0.9; %附加動量因子以避免造成局部極值

net.trainParam.show=10; %每10步顯示一次結果net.trainParam.lr=0.01; %網(wǎng)絡學習速率為0.01

net.trainParam.lr_inc =1.01; %速率遞增因子1.01 [net,tr]=train(net,P,T); %訓練網(wǎng)絡

input_test=[1,1,1,1;1,2,2,2;1,3,3,3;1,4,4,4;2,1,2,3;2,2,1,4; 2,3,4,1;2,4,3,2;3,1,3,4;3,2,4,3;3,3,1,2;3,4,2,1;4,1,4,2;4,2,3,1;4,3, 2,4;4,4,1,3]; %預測樣本

Out=sim(net,input_test'); %預測樣本仿真Out=Out'; %仿真值

error=abs(Out-T_test'); %預測誤差

w1=net.iw{1,1}; %輸入層到隱含層的權值

w2=net.lw{2,1}; %隱含層到輸出層的權值

theta1=net.b{1}; %隱含層的閾值

theta2=net.b{2}; %輸出層的閾值

利用以上程序進行網(wǎng)絡訓練，其訓練結果如下：

TRAINLM, Epoch 0/1000, MSE 4282.78/0.1, Gradient 3642.94/1e-010

TRAINLM, Epoch 10/1000, MSE 34.2004/0.1, Gradient 196.496/1e-010

TRAINLM, Epoch 20/1000, MSE 4.2621/0.1, Gradient 7.34127/1e-010

TRAINLM, Epoch 30/1000, MSE 3.39664/0.1, Gradient 3.27436/1e-010

TRAINLM, Epoch 40/1000, MSE 1.31104/0.1, Gradient 11.7193/1e-010

TRAINLM, Epoch 44/1000, MSE 0.092635/0.1, Gradient 32.7328/1e-010

TRAINLM, Performance goal met.

訓練誤差下降曲線見圖4：

圖4 神經(jīng)網(wǎng)絡誤差下降曲線Fig.4 Error drop curve for the neural network

由圖4的誤差下降曲線及相應的訓練結果分析可知，網(wǎng)絡訓練穩(wěn)定且較迅速，訓練至第44步時，達到要求。對已存在的1～16組的試驗條件進行仿真，其結果見表4。

表4 試驗結果及其神經(jīng)網(wǎng)絡仿真Table 4 Experimental result and its neural network simulation

由表4的神經(jīng)網(wǎng)絡仿真結果與正交試驗結果比較可以看出，神經(jīng)網(wǎng)絡的仿真誤差普遍較小，具有更高的仿真精度。

同時，由訓練輸出可知，輸入層到隱含層的權值(W11)、隱含層到輸出層的權值(W21)、隱含層的閾值(b1)及輸出層的閾值(b2)分別為：

W11=[4.079,0.26453,-2.8772,5.2396;-0.48833,-2.7773, -7.2506,4.7305;-2.6067,-5.3694,-1.2416,1.8823;5.7181, 5.3792, 7.9683,5.3205;-3.664,1.2181,-6.0325,5.3109;1.7089, 0.7168, -1.5915,3.4716;7.0217,3.6985,-2.787,8.3019; -0.069358,0.15506,1.9939,2.6288;-1.8224,-1.0125, -1.8048,1.1463;-0.62046,4.3802, -1.1339,1.5391;1.7924, 6.7603, 5.5021,0.59415;2.1583,0.68257, 1.1043,0.71409;2.7294, 2.1755,0.26396,2.9087]

W21=[-9.5735,7.6279,4.3,6.851,-13.407,12.276,7.8403, 5.9322,-1.684,8.3296,8.4501,10.763,13.67]

b1= [-3.3402,-0.56794,5.4582,0.42737,2.1024,-7.9307, -4.9651,1.5866,-4.4519,-4.226,5.8153,5.5717,3.1436]

b2= [14.349]

利用上述權值及閥值，采用函數(shù)(Y=p u r e l i n (W21tansig(W11P1+b1)+b2))進行最佳條件的尋找及結果預測，神經(jīng)網(wǎng)絡求得最佳條件為A=2.8，B=3.1，C=3.2，D=3.8，即底物秸稈糖質量濃度為126g/L ，活性炭添加量為2.48g/L，大孔樹脂添加量為1.6g/L，搖瓶轉速為234r/min時，此條件下的神經(jīng)網(wǎng)絡仿真預測產(chǎn)L-乳酸值為86.735g/L，而驗證實驗表明該條件下產(chǎn)L-乳酸為86.9g/L，預測誤差為0.165g/L。與正交試驗的直觀分析結果(82.5g/L)及極差分析結果(82.8g/L)相比，分別高出4.4g/L與4.1g/L，神經(jīng)網(wǎng)絡分析表現(xiàn)出了對最佳條件較精確的預測能力，并在一定程度上提高了產(chǎn)物的產(chǎn)量。

正交試驗與神經(jīng)網(wǎng)絡分析均表明，較適宜的底物碳源質量濃度能夠生成較高質量濃度的L-乳酸，一旦底物質量濃度過高，將可能產(chǎn)生底物抑制，同時，由于秸稈水解液中大量抑制劑的存在，過高的糖質量濃縮必然伴隨著抑制劑的增加，將對菌體的生長及產(chǎn)酸不利，從而可能降低最終的發(fā)酵效果?；钚蕴颗c大孔樹脂的添加能夠通過吸附水解液中的抑制劑而達到促進發(fā)酵的效果，尤其活性炭對糠醛類抑制劑的吸附明顯，能夠顯著緩解發(fā)酵的抑制[14]。但過量的活性碳則不利于發(fā)酵效率的提升，可能由于活性炭在吸附抑制劑的過程中也吸附底物糖，較低質量濃度的活性炭盡管也存在糖吸附，隨著發(fā)酵的進行，溶液中糖的消耗能夠及時促進活性炭中的糖釋放，而過高的活性炭顯著吸附抑制劑，同時也伴隨相當量的糖的吸附，一旦被吸附的糖不能及時析出或者析出速率低于發(fā)酵的耗糖速率，則可能不利于菌體的總體發(fā)酵，從而表現(xiàn)出產(chǎn)酸的降低。同樣，大孔樹脂能夠顯著吸附苯類物質，從而在一定程度上提升發(fā)酵效率。

米根霉是嚴格的好氧微生物，搖瓶發(fā)酵過程中，在一定的裝液量條件下，保持較高的轉速能夠顯著提升溶液中的溶氧，從而間接提升發(fā)酵產(chǎn)酸。

3 結 論

酸堿及汽爆處理能夠有效降解小麥秸稈制備水解糖，但是水解液中抑制劑的存在明顯降低發(fā)酵效果[15]，對水解液中糖進行單獨分離后再發(fā)酵，則分離成本過大。在本實驗中，吸附劑的使用與發(fā)酵過程保持同步，即在發(fā)酵過程中通過活性炭及大孔樹脂對秸稈水解液中的糠醛類、苯類抑制劑進行在線選擇性吸附，實現(xiàn)了菌株對秸稈糖液的高效轉化與利用。同時本研究圍繞主要工藝參數(shù)在正交試驗調控基礎上，對實驗結果進行BP神經(jīng)網(wǎng)絡的仿真與較優(yōu)條件的預測，結果顯著提升發(fā)酵產(chǎn)酸。

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Optimization of Fermentation Conditions for L-Lactic Acid Production from Wheat Straw Hydrolysate

LI Xing-jiang1，YANG Wei-hua2，JIANG Shao-tong1，PAN Li-jun1
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Anhui Fengyuan Group, Bengbu 233010, China)

In the present study, wheat straw hydrolysate was fermented in a 500 mL shaking flask to prepare high-optical purity L-lactic acid for effectively elevating the utilization value of the agricultural waste. Considering metabolitic inhibition probably occurring during fermentation, the optimization of wheat straw hydrolysate concentration, amounts of added HN-Y13 type activated carbon and DM11 type macroporous resin as adsorbents to the fermentation inhibitors in wheat straw hydrolysate and shaking speed was carried out using orthogonal array design and back-propagation artificial neural network (BP-ANN). From the results of orthogonal array experiments, it was found that L-lactic acid production was remarkably influence by all the above four factors and reached up to 82.8 g/L under optimized conditions determined through range analysis. The optimal values of wheat straw hydrolysate concentration, amounts of added HN-Y13 type activated carbon and DM11 type macroporous resin and shaking speed were predicted with BP-ANN to be 126, 2.48 g/L and 1.6 g/L, and 234 r/min, respectively. The yield of L-lactic acid was 86.9 g/L under these conditions, much higher than before optimization.

wheat straw hydrolysate；Rhizopus oryzae；L-lactic acid；orthogonal array design；BP neural network

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0169-05

2010-09-15

國家自然科學基金項目(31071636)；安徽省自然基金項目(090411010)；安徽省高校自然科學基金項目(KJ2010A262)

李興江(1978—)，男，講師，博士，主要從事微生物發(fā)酵工程研究。E-mail：lixingjiang1978@hfut.edu.cn