Lactobacillus paracaseiW2合成苯乳酸培養(yǎng)條件的優(yōu)化

劉 戈，王立梅*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程系，江蘇 常熟 215500；3.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟 215500)

Lactobacillus paracaseiW2合成苯乳酸培養(yǎng)條件的優(yōu)化

劉 戈1，王立梅2,3,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程系，江蘇 常熟 215500；3.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟 215500)

對苯乳酸(PLA)高產(chǎn)菌株副干酪乳桿菌Lactobacillus paracaseiW2的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高PLA合成能力。采用Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計法，篩選出3個主要影響因子：葡萄糖、吐溫-80、苯基丙酮酸(PPA)。通過最陡爬坡法和響應(yīng)面分析方法(RSM)確定葡萄糖質(zhì)量濃度19.5g/L、吐溫-80 4mL/L、苯基丙酮酸質(zhì)量濃度3g/L。在此優(yōu)化條件下，Lactobacillus paracaseiW2發(fā)酵合成苯乳酸的產(chǎn)量達(dá)到801mg/L，比優(yōu)化前提高1.4倍。

Lactobacillus paracaseiW2；苯乳酸；最陡爬坡法；Plackett- Burman設(shè)計；響應(yīng)面分析

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羥基-3-苯基丙酸，也稱β-苯乳酸或3-苯基乳酸，是一種新型的抑菌物質(zhì)[1-4]。苯乳酸的抑菌譜廣，對革蘭氏陽性細(xì)菌如S.aureus、L.monocytogenes，革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌、沙門氏菌和真核微生物如曲霉屬的黑曲霉、黃曲霉，青霉屬的婁地青霉、團(tuán)青霉等均有抑制作用[5-6]。苯乳酸作為天然防腐劑被應(yīng)用于食品工業(yè)，也用于醫(yī)藥和化妝品工業(yè)[7-10]。

自1986年以來，國內(nèi)外已經(jīng)著手于苯乳酸的研究[11]。它可由多種微生物產(chǎn)生，但由于乳酸菌是GRAS微生物[6]，更適合應(yīng)用于食品行業(yè)。所以，利用乳酸菌生產(chǎn)苯乳酸成為研究的熱點(diǎn)。2000年，Lavermicocca[2]分離到的植物乳桿菌(L.plantarum 21B)生產(chǎn)苯乳酸，產(chǎn)量為56mg/L。隨后研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了不同種屬的乳酸菌產(chǎn)生的苯乳酸，2002年，SRTROM等[12]分離的L.plantarum MiLAB 393，產(chǎn)生S型和R型3-苯乳酸的比例為9:1。Magnusson等[13-14]從青草中分離出苯乳酸的產(chǎn)生菌株，經(jīng)鑒定為棒狀乳1桿菌(L ac t o ba c i ll u s coryniformis)。2004年，Valerio等[15]研究發(fā)現(xiàn)許多乳酸菌都能產(chǎn)生苯乳酸，但產(chǎn)量比較低。2007年，李興峰[3]從中國傳統(tǒng)的泡菜中篩選的植物乳桿菌(Lactobacillus sp. SK007)產(chǎn)生苯乳酸的量達(dá)91mg/L。迄今為止，由副干

酪乳桿菌合成PLA還未報道，本實(shí)驗(yàn)以Lactobacillus paracaseiW2為研究對象，對其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，旨在為其規(guī)?；l(fā)酵及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

副干酪乳桿菌Lactobacillus paracaseiW2，本實(shí)驗(yàn)室篩選并在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。

苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司；乙酸乙酯、甲酸、葡萄糖、蛋白胨 上?；瘜W(xué)試劑廠。

培養(yǎng)基采用MRS培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 PLA的提取

將發(fā)酵液離心、過濾后用甲酸調(diào)節(jié)酸度至pH2，用乙酸乙酯萃取，然后減壓濃縮。

1.2.2 檢測方法

采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測苯乳酸含量。色譜條件：色譜柱：C18柱；流動相：A為0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B為0.05%三氟乙酸水溶液；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；總流速：1mL/min；進(jìn)樣量為5μL。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計

1.2.3.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以PLA的濃度作為響應(yīng)值，選擇培養(yǎng)基組分中的7個因素作為研究對象，即：蛋白胨(X1)、酵母膏(X2)、PPA(X4)、乙酸鈉(X5)、葡萄糖(X7)、吐溫-80(X9)、磷酸氫二鉀(X10)。另外選擇3個虛擬變量，用來估算誤差。本試驗(yàn)選用10因素，N=12次的試驗(yàn)表格，篩選出3個主效應(yīng)影響因子。

1.2.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的3個重要因素設(shè)計最陡爬坡試驗(yàn)，檢測PLA含量，以確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

1.2.3.3 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計

在PB試驗(yàn)及最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響合成PLA的3個主要因素為自變量，以PLA產(chǎn)量為考察指標(biāo)，采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計，進(jìn)行三因素五水平的RSM試驗(yàn)，以確定最優(yōu)濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)

由表1可知，葡萄糖＞吐溫-80＞PPA在7個考察因素中顯著性最高，葡萄糖是微生物生命活動的能量來源；PPA是PLA的合成前體；吐溫-80作為表面活性劑可以刺激菌體的生長。所以選這3個因素作為重要因素，在以下的研究工作中對其進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。其他4個因素根據(jù)效應(yīng)性選擇試驗(yàn)水平，即：蛋白胨(X1)選擇高水平，酵母膏(X2)、乙酸鈉(X5)和K2HPO4(X10)選擇低水平。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of Plackett-Burman design

主要因素的編碼多元一次回歸方程為：Y=0.664-0.055X4-0.089X7+0.084X9。該方程的相關(guān)性R2=0.9395，該模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在6.74%的失真，相關(guān)性較好。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Steepest ascent design and experimental results

由表2可知，在0階段的PLA產(chǎn)量最高，可達(dá)835mg/L。因此，在以下的響應(yīng)面試驗(yàn)中，將0階段試驗(yàn)組作為中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

2.3 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)及響應(yīng)面分析

表3 試驗(yàn)因素水平和編碼Table 3 Levels and codes of factors in central composite design

根據(jù)表3試驗(yàn)因素水平和編碼，以PLA產(chǎn)量為響應(yīng)

值Y，中心組合試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計表及試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Central composite design matrix and experiment results

20個試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類：一是析因點(diǎn)，自變量取值在其所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共12個析因點(diǎn)；二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，用以估算實(shí)驗(yàn)誤差。以PLA的產(chǎn)量為響應(yīng)值，利用SAS軟件對表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到關(guān)于PLA產(chǎn)量(Y)對葡萄糖(X1)、PPA(X2)、吐溫-80 (X3)的多元回歸方程：

Y=0.827024+0.004151X1-0.025132X2+0.000323X3-0.066368X12+0.006625X1X2-0.002125X1X3-0.164302X22+ 0.007625X2X3-0.087228X32

該回歸方程R2=0.9601，說明回歸方程和實(shí)際擬合效果良好，可以用于試驗(yàn)結(jié)果的分析和預(yù)測。

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 5 Significance tests of regression coefficients of the established quadratic model

由表5的方差分析結(jié)果表明，X12、X22、X32對PLA產(chǎn)量的影響極其顯著(P＜0.01)，它們對PLA產(chǎn)量影響的大小順序?yàn)椋篨22=X32＞X12，由此建立的模型也極為顯著，而X1、X2、X3及這3個主效應(yīng)因子之間的交互作用對PLA產(chǎn)量的影響不顯著(P＞0.05)，由此可見各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不呈線性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系。

圖1 PLA產(chǎn)量響應(yīng)面立體分析圖Fig. 1 Three-dimensional response surface diagrams showing the pairwise interactive effects of three factors on PLA production

由圖1可知，該回歸方程存在極大值點(diǎn)。該組圖對3個主效應(yīng)因子對PLA產(chǎn)量的兩兩交互作用進(jìn)行了評價。根據(jù)回歸方程，可得到最佳因素編碼：X1=0.028、X2=-0.076、X3=-0.002，對應(yīng)的真實(shí)值近似為：葡萄糖19.5g/L、PPA 3g/L、吐溫-80 4mL/L。在此最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，PLA的預(yù)測產(chǎn)量為828mg/L。為了驗(yàn)證模型的有效性和準(zhǔn)確性，用最優(yōu)的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，得到的PLA的真實(shí)產(chǎn)量為801mg/L，是優(yōu)化前發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量的1.4倍，可真實(shí)的反應(yīng)各因素對PLA產(chǎn)量的影響。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，通過PB試驗(yàn)設(shè)計從影響PLA合成的Lactobacillus paracaseiW2發(fā)酵培養(yǎng)基中找出3個主效應(yīng)因子，分別為葡萄糖、PPA、吐溫-80，其他因素選取各自的最佳水平。然后通過Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計對這3個主要因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，其優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為葡萄糖19.5g/L、苯丙酮酸3g/L、吐溫-80 4mL/L。在此條件下，苯乳酸的產(chǎn)量為801mg/L，比優(yōu)化前提高了1.4倍。

[1]DIEULEVEUX V, van DER PYL D, CHATAUD J, et al. Purification and characterization of anti-Listeria compounds produced by Geotrichum candidum[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(2): 800-803.

[2]LAVERMICOCCA P, VALERIO F, EVIDENTE A, et al. Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(9): 4084-4090.

[3]李興峰, 江波, 潘蓓蕾, 等. 產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌分離篩選及菌種鑒定[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(2): 1-4.

[4]SCHNURER J, MAGNUSSON J. Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives[J]. Trends Food Sci Technol, 2005, 16: 70-78.

[5]DIEULEVEUX V, LEMARINIER S, GUEGUEN M. Antimicrobial spectrum and target site of D-3-phenyllactic acid[J]. Intern J Food Microbiol, 1998, 40(3): 177-183.

[6]LAVERMICOCCA P, VALERIO F, VISCONTI A. Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(1): 634-640.

[7]江明華, 林華, 施勤, 等. β-苯基乳酸對離體小鼠子宮的平滑肌作用[J]. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 1990, 17(5): 350-354.

[8]李德茂, 李從發(fā), 劉四新, 等. 3-苯基乳酸的研究進(jìn)展[J]. 藥物生物技術(shù), 2004, 11(5): 344-347.

[9]薛芬, 邵以德. 一種帶節(jié)育器出血的治療藥物及其制備方法:中國, CN1141772[P]. 1997-02-05.

[10]YU R J, van SCOTT E J. Method of using 3-phenyllactic acid for treating wrinkles: US, 5643953[P]. 1997-07-01.

[11]KAMATA M, TOYOMASU R, SUZUKI D, et al. D-phenyllactic acid production by Brevibacterium or Corynebacterium:JP, 86108396[P]. 1986-05-03.

[12]STROM K, SJOGREN J, BROBERG A, et al. Lactobacillus plantarum MILAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides Cyclo (L-Phe-LPro) and Cyclo (L-phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-Phenyllactic acid[J]. Applied and Environmental Microbilolgy, 2002, 68(9): 4322-4327.

[13]MAGNUSSON J, STROM K, ROOS S, et al. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria [J]. FEMS Microbiology Letters, 2003, 219(1): 129-135.

[14]MAGNVSSON J. Antigungal activity of lactic acid bacteria[D]. Uppsala, Sweden:Swedish University of Agricultural Sciences, 2003.

[15]VALERIO F, LAVERMICOCCA P, PASCALE M, et al. Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria: an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 233(2): 289-295.

Optimization of Culture Medium for Phenyllactic Acid Production by Lactobacillus paracasei W2

LIU Ge1，WANG Li-mei2,3,*
(1. College of Food Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Department of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China；3. Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology, Changshu 215500, China)

The optimal medium for phenyllactic acid (PLA) production by Lactobacillus paracasei W2 was investigated in order to improve PLA yield. Three most significant components affecting PLA production were selected out of seven components using Plackett-Burman design, namely glucose, Tween-80 and phenylpyruvic acid. Their optimal concentrations were determined by steepest ascent method and response surface methodology (RSM) to be 19.5 g/L, 4 mL/L and 3 g/L, respectively. PLA production reached 801 mg/L under these conditions, 1.4-fold higher than before optimization.

Lactobacillus paracasei W2；PLA；steepest ascent method；Plackett-Burman design；response surface methodology

Q939.11

A

1002-6630(2010)23-0174-04

2010-09-15

江蘇省科學(xué)技術(shù)局(BE2008391)；常熟市科技局資助項(xiàng)目(CN200921)

劉戈(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與功能性食品。E-mail：liuge19840512@163.com

*通信作者：王立梅(1964—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wlmqb@126.com