生物富硒對沼澤紅假單胞菌G3菌株營養(yǎng)組分的影響

楊啟銀，劉淑超，賈秉晟，王家芳，曩瀟瀟

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046； 2.南京市微生物工程技術研究中心，江蘇 南京 210046；3.江蘇省微生物資源工程化技術研究中心，江蘇 南京 210046；4.南京紅太陽集團，江蘇 南京 210031)

生物富硒對沼澤紅假單胞菌G3菌株營養(yǎng)組分的影響

楊啟銀1,2,3，劉淑超1，賈秉晟1，王家芳1，曩瀟瀟4

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046； 2.南京市微生物工程技術研究中心，江蘇 南京 210046；3.江蘇省微生物資源工程化技術研究中心，江蘇 南京 210046；4.南京紅太陽集團，江蘇 南京 210031)

為了探討生物富硒對沼澤紅假單胞菌的營養(yǎng)品質的影響，對富硒沼澤紅假單胞菌G3菌株和普通沼澤紅假單胞菌的一般營養(yǎng)成分、氨基酸、B族維生素、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)進行測定。結果表明：富硒培養(yǎng)的沼澤紅假單胞菌總硒含量為875.03μg/g，其中有機硒含量為847.42μg/g，有機硒轉化率為96.85%。富硒沼澤紅假單胞菌G3菌株的蛋白質、菌體可溶性糖和粗脂肪的含量分別比普通沼澤紅假單胞菌提高了9.10%、5.13%和42.86%，灰分含量則比普通菌降低了23.73%。富硒沼澤紅假單胞菌菌體含有17種氨基酸，普通菌體含有16種氨基酸，富硒沼澤紅假單胞菌菌體的多種氨基酸含量均高于普通菌，其中人體必需的蛋氨酸和賴氨酸分別比對照提高了100%和9.2%。富硒沼澤紅假單胞菌的VB2、VB6、煙酸和類胡蘿卜素與對照組相比均明顯提高，VB2的含量提高了6.45%，VB6的含量提高了5.77%，煙酸的含量提高了7.20%，類胡蘿卜素含量提高了45.08%，VB1與對照組相比下降了9.2%，富硒沼澤紅假單胞菌菌體的SOD酶和CAT酶活性明顯提高，分別比普通菌高158.43%和54.51%。

生物富硒；沼澤紅假單胞菌；營養(yǎng)成分；評價

硒是人體和動物必需的一種微量元素，具有多種特殊的生理功能，在1957年Schwarz等[1]證實硒能夠防止大鼠肝壞死，也能促進動物生長，并把它列為一種必需的生命元素。在此之前，人們對硒的研究一直只注

重它的毒害作用。直到1975年，Awasthi等[2]才首次明確指出，硒是人體必需的微量元素。近年來，研究發(fā)現(xiàn)硒是人體GPX(谷胱甘肽過氧化物酶)家族硒蛋白P和硒蛋白W的重要組成部分，在人體中發(fā)揮重要生理功能，具有預防心腦血管疾病、抗腫瘤、提高免疫、促進人體生長發(fā)育等作用[3-6]。當飲水、動物飼料及環(huán)境中硒含量過低時，人和動物就會出現(xiàn)硒缺乏癥[5-6]。為了解決這一問題，最有效的方法就是補充適量的硒。許多研究表明[7-13]，相對于無機硒，生物源有機硒具有吸收利用率高、生物活性強、毒性低、環(huán)境污染小等優(yōu)點，所以，生物富硒的研究日益受到重視。

沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是光合細菌的代表菌株之一，分布于水田、池塘、湖泊等，被廣泛應用于農業(yè)、畜牧業(yè)、漁業(yè)、環(huán)保、保健食品和醫(yī)藥等領域[14-16]。沼澤紅假單胞的蛋白質和氨基酸含量較高，是一種優(yōu)質蛋白源，同時還含有多種生物活性物質、B族維生素以及16種人體必需氨基酸等，具有很高的營養(yǎng)價值[17-18]。本實驗室在對沼澤紅假單胞菌的研究中發(fā)現(xiàn)，菌體在生長過程中有很強的轉化有機硒的能力。本研究通過分析富硒沼澤紅假單胞菌G3菌的營養(yǎng)成分，為富硒沼澤紅假單胞菌G3菌的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustris G3由本實驗室分離保存，富硒沼澤紅假單胞菌G3由本實驗室制備。

鄰苯二胺、磷酸、鹽酸、硫酸、無水乙酸鈉、無水乙醇、甲苯、石油醚、丙酮等均為分析純；亞硒酸鈉為試劑級；乙腈、甲醇為色譜純；β-胡蘿卜素標品 德國Merk公司。

1.2 儀器與設備

SKD-200凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；A200氨基酸自動分析儀 德國安米諾公司；Waters 201DC型高效液相色譜儀 美國沃特斯科技(上海)有限公司；UV-2802S紫外分光光度計 上海洪富儀器儀表有限公司；Sigma-30K高速冷凍離心機 美國奧博塔科技(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沼澤紅假單胞菌耐硒能力的馴化[19]

挑取活化后的沼澤紅假單胞菌G3菌株單菌落，在添加亞硒酸鈉分別為10-5、10-4、10-3、10-2mol/L的固體培養(yǎng)基平板上劃線，對沼澤紅假單胞菌G3菌株進行硒濃度梯度馴化。每次都挑取長得大且好的單菌落到含有更高濃度亞硒酸鈉的平板上，直到無法生長。重復2～ 3次，挑取具有最高耐受量的單菌落于無硒平板上劃線分離，30℃光照培養(yǎng)，由此得到可正常生長的耐硒菌株。當培養(yǎng)基中亞硒酸鈉濃度達到10-2mol/L時，菌體無法生長，因此從亞硒酸鈉濃度為10-3mol/L的平板上挑取單菌落于無硒平板中劃線分離，置于30℃光照培養(yǎng)，得到可正常生長的耐硒菌株。

1.3.2 富硒沼澤紅假單胞菌硒含量的測定

參照魏彩霞等[20]的方法測定。

1.3.3 硒標準曲線的繪制

吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL硒標準液于三角瓶中，配制硒質量濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL的溶液，以OD335nm為橫坐標，硒質量濃度(μg/mL)為縱坐標，繪制標準曲線。得出硒含量標準曲線的回歸方程為Y=0.1721X＋0.0021 (R2＝0.9996)。

1.3.4 有機硒含量及轉化率

1.3.5 營養(yǎng)成分測定

灰分測定：550℃干法灰化法；蛋白質測定：凱氏定氮法；粗脂肪測定：索氏抽提法；可溶性糖測定：DNS法；氨基酸測定：HPLC法；VB1、VB2和煙酸的測定：HPLC法；類胡蘿卜素測定：紫外分光光度法；標準曲線繪制及樣品處理參照朱秀靈等[21]的方法。

1.3.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

蛋白質含量測定采用Bradford[22]的方法，以BSA為標準蛋白，SOD酶比活力以U/mg pro表示。

1.3.7 過氧化氫酶(CAT)活性測定

參照徐鏡波等[23]的方法，酶活以100s內使過氧化氫分解一半時的酶蛋白量表示。

2 結果與分析

2.1 亞硒酸鈉濃度對沼澤紅假單胞菌G3生長的影響

圖1 亞硒酸鈉濃度對G3菌生長的影響Fig.1 Effect of Na2SeO3concentration on the growth ofRhodopseudomonas palustrisG3

由圖1可知，沼澤紅假單胞菌G3菌株經(jīng)馴化后，對亞硒酸鈉的耐受性有了很大的提高，當亞硒酸鈉濃度在4×10-5mol/L以下時，對沼澤紅假單胞菌G3菌株的生長基本沒有影響，在適宜的濃度下，對沼澤紅假單胞菌G3菌株的生長有促進作用，在5×10-5mol/L濃度時對菌株生長略有影響。因此，4×10-5mol/L為富硒培養(yǎng)的理想濃度。

表1 富硒G3菌硒含量Table 1 Content of Se in selenium-enrichedRhodopseudomonas palustrisG3

由表1可知，經(jīng)富硒培養(yǎng)的沼澤紅假單胞菌總硒含量為875.03μg/g，其中有機硒含量為847.42μg/g，有機硒轉化率為96.85%。

2.2 硒對沼澤紅假單胞菌G3菌株一般營養(yǎng)成分的影響

表2 富硒G3菌和普通對照菌主要營養(yǎng)成分的比較Table 2 Comparison of major nutritional components in Se-enriched and normalRhodopseudomonas palustrisG3%

由表2可知，粗蛋白、可溶性糖類和粗脂肪，實驗組與對照組比較分別提高了9.10%、5.13%、42.86%，而粗灰分含量，處理組減少了23.73%。

2.3 硒對沼澤紅假單胞菌G3菌株氨基酸含量的影響

表4 沼澤紅假單胞菌和富硒沼澤紅假單胞菌G3菌株維生素含量的分析Table 4 Analysis of vitamin content in Se-enriched and normalRhodopseudomonas palustrisG3μg/g

表3 沼澤紅假單胞菌和富硒沼澤紅假單胞菌G3菌株氨基酸成分分析Table 3 Amino acid analysis of Se-enriched and normalRhodopseudomonas palustrisG3%

表5 G3菌株菌體SOD酶活和CAT酶活測定的結果Table 5 Activities of SOD and CAT in Se-enriched and normalRhodopseudomonas palustrisG3

由表3可知，除色氨酸和胱氨酸因含量不高水解時被破壞未檢測出外，對照組中蛋白質含16種氨基酸，總氨基酸含量為87.94%，必需氨基酸總含量為36.98%，占總氨基酸含量的42.05%；必需氨基酸中亮氨酸含量最高，占總氨基酸的6.84%，胱氨酸未檢測到；非必需氨基酸總含量為50.96%，占總氨基酸含量的57.95%，其中谷氨酸含量最高，為10.05%，組氨酸最低，含量為1.66%。實驗組菌體蛋白質含17種氨基酸，總氨基酸含量達96.77%，必需氨基酸總含量為39.13%，占總氨基酸含量的40.44%，其中亮氨酸含量最高，占總氨基酸的7.36%；非必需氨基酸總含量為57.64%，占總氨基酸含量的59.56%，其中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的11.5%，胱氨酸含量最低，占總氨基酸的1.1%。實驗組總氨基酸較對照組提高了10.04%，必需氨基酸含量較對照組提高了5.81%，非必需氨基酸含量較對照組提高了13.11%。

實驗組的天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸和精氨酸均高于對照組，其中人體必需的8種氨基酸中，實驗組的亮氨酸、蛋氨酸和賴氨酸均明顯高于對照組，分別提高了7.6%、100%和9.2%；比較實驗組與對照組的異亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、組氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸的含量，二者沒有差異。

2.4 硒對沼澤紅假單胞菌G3菌株B族維生素和類胡蘿卜素含量的影響

由表4可知，沼澤紅假單胞菌的B族維生素十分豐富，實驗組的VB2、VB6、煙酸和類胡蘿卜素均高于對照組，VB2、VB6、煙酸和類胡蘿卜素分別提高了6.45%、5.77%、7.20%和45.08%，類胡蘿卜素的提高尤為明顯；實驗組VB1含量比對照組下降了9.2%。2.5硒對沼澤紅假單胞菌G3菌株SOD酶活和CAT酶活性的影響

由表5可知，實驗組和對照組的蛋白含量、SOD

酶活和CAT酶活都比較高，實驗組的蛋白含量、SOD酶活和CAT酶活分別為0.39μg/μL、2.30U/μg、8.90U/μg，與對照組比較，分別提高了34.48%、158.43%和54.51%。

3 討論與結論

3.1 本實驗結果表明，沼澤紅假單胞菌G3菌株在硒濃度為4×10-5mol/L的條件下，經(jīng)硒脅迫馴化培養(yǎng)總硒含量可達875.03μg/g[13]，其中無機硒含量27.61μg/g、有機硒含量為847.42μg/g、有機硒轉化率為96.85%。硒處理G3菌的營養(yǎng)組分也發(fā)生了變化，蛋白質提高了9.10%、可溶性糖含量提高了5.13%、脂肪含量提高了42.86%，粗灰分下降了23.73%。對照組的粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分的檢測結果與莊傳東等[18]對沼澤紅假單胞菌營養(yǎng)成分分析結果基本一致；實驗組的粗脂肪和粗灰分的實驗結果與莊傳東等[18]對粗脂肪和粗灰分的檢測結果有明顯差別。本實驗中實驗組粗脂肪含量高于對照組，與李志勇等[12]報道的富硒螺旋藻脂肪含量低于普通螺旋藻不一致，這可能是由于不同生物體的富硒途徑不同，富硒沼澤紅假單胞菌G3菌對脂的積累與合成有促進作用，具體機制有待進一步研究。

3.2 硒實驗組主要營養(yǎng)組分檢測結果表明：硒實驗組的蛋白質含有17種氨基酸，總氨基酸含量達96.77%，必需氨基酸總量為39.13%，非必需氨基酸總量為57.64%，必需氨基酸占總氨基酸含量的40.44%，非必需氨基酸占總氨基酸含量的59.56%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(E/N)為0.68。對照組菌體的蛋白質含有16種氨基酸，總氨基酸含量達87.94%，必需氨基酸總量為36.98%，非必須氨基酸50.96%，必需氨基酸占總氨基酸含量的42.05%，非必需氨基酸占總氨基酸含量的57.95%，E/N為0.73。根據(jù)FAO/WHO對飼料蛋白的理想模式[17-18,23]，質量較優(yōu)的蛋白質氨基酸組成，必需氨基酸含量(E)應在40%～60%，E/N在0.6以上[24]，實驗組的E/N為0.68，對照組的E/N為0.73，其比值均超過了0.6。這與莊傳東等[18]對沼澤紅假單胞菌的氨基酸成分分析結果基本一致。

3.3 比較了硒實驗組G3菌和對照組G3菌的粗蛋白含量：硒實驗組G3菌為66.80%，對照組G3菌為61.23%，硒G3菌提高了9.1%。因此，可以認為硒實驗組G3菌和沼澤紅假單胞菌G3菌都是一種營養(yǎng)組分較為齊全的蛋白原料，經(jīng)硒處理的G3菌更是一種具開發(fā)價值的優(yōu)質原料。

3.4 硒實驗組G3菌的天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸和精氨酸均高于對照組，其中蛋氨酸和賴氨酸差異明顯，分別提高了100%和9.2%，而其余氨基酸與對照組沒有差異，由于蛋氨酸和胱氨酸是含硫氨基酸，這兩類氨基酸與硒在體內的轉化代謝密切相關。因為硒和硫屬于同一主族，性質相似，硒在體內代謝的途徑往往是沿著硫代謝的途徑進行，具有相同的酶體系，取代含硫氨基酸中的硫，生成硒代氨基酸，以硒代半胱氨酸的形式特異性地與蛋白結合，或以硒代蛋氨酸的形式非特異性地與蛋白結合[14]。因此在適宜的硒濃度下，無機硒進入菌體，轉化為有機硒，參與菌體的生長和代謝，存在使蛋白質含量增加的可能性，添加適量的硒可以增加菌體蛋白質中氨基酸的總量。這與胡文軍等[11]報道的添加一定量的硒，菌體能合成高含量的蛋白質的結果相一致。但胱氨酸的分析與吳向華等[17]報道的結果不同，這可能是培養(yǎng)條件和檢測儀器及方法不同所致，其原因有待進一步研究。

3.5 與其他生物相比，沼澤紅假單胞菌G3菌的B族維生素和類胡蘿卜素的含量要高得多，經(jīng)硒處理的G3菌B族維生素更為豐富，VB2、VB6、煙酸的含量分別為57.80、22.72、32.18μg/g ，與對照相比提高了6.45%、5.77%、7.20%；類胡蘿卜素為1293.24μg/g，與對照相比提高了45.08%；說明硒對菌體B族維生素和類胡蘿卜素的合成有影響，此實驗結果與吳向華等[17]對沼澤紅假單胞菌的B族維生素和類胡蘿卜素檢測基本一致。B族維生素是各種酶的活性基的組成部分，與核酸的合成有密切關系，能參與動物生長發(fā)育、有機體神經(jīng)代謝、氨基酸代謝和脂肪代謝[25]；類胡蘿卜素和β-胡蘿卜素都具有抗氧化作用，是人和動物需要的生物活性物質，在食品、醫(yī)學和飼料等領域都有廣泛應用。實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組VB10.76μg/g，對照組VB10.83μg/g，實驗組反而比對照下降了9.2%，具體原因有待進一步研究。3.6本實驗對SOD酶和CAT酶檢測發(fā)現(xiàn)，硒實驗組G3菌較沼澤紅假單胞菌G3菌均有明顯提高，SOD酶活性提高了158.43%，CAT酶活性提高了54.51%，硒實驗組的這兩種酶活如此之高，可能是硒誘導和促進了SOD酶活和CAT酶活的產生，因為抗氧化性是硒的生化作用基礎[7]，說明硒能對沼澤紅假單胞菌的生長和代謝產生影響。

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Effect of Selenium Enrichment on Nutritional Composition of Rhodopseudomonas palustris G3

YANG Qi-yin1,2,3，LIU Shu-chao1，JIA Bing-sheng1，WANG Jia-fang1，NANG Xiao-xiao4
(1. College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2. Nanjing Engineering and Technology Research Center for Microbiology, Nanjing 210046, China；3. Jiangsu Engineering and Technology Research Center for Microbial Resources, Nanjing 210046, China；4. Nanjing Redsun Co. Ltd., Nanjing 210031, China)

In order to explore the effect of selenium enrichment on nutritional compositions of Rhodopseudomonas palustris, general nutrients, amino acids, vitamin B family, nicotinic acid, β-caroteneare, superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in selenium-enriched Rhodopseudomonas palustris (sRP) and normal Rhodopseudomonas palustris (nRP) were compared. Results indicated that the contents of protein, soluble sugar and crude fat of sRP were higher than those of nRP, which exhibited an enhancement by 9.10%, 5.13% and 42.86%, respectively. Whereas, the ash content of sRP was lower than that of nRP with a decrease by 23.73%. In addition, totally 17 amino acids were detected in sRP, while only 16 amino acids was detected in nRP. Moreover, the contents of amino acids in sRP were much higher than those in nRP, especially for methionine and lysine with an increase by 100% and 9.2%, respectively. Vitamin B2, vitamin B6, nicotinic acid and carotenoid in sRP were 6.45%, 5.77%, 7.20% and 45.08%, which were also higher than those in nRP, respectively. However, the content of vitamin B1 in sRP was lower than nRP. The activities of SOD and CAT in sRP exhibited an enhancement of 158.43% and 54.51% when compared with those in nRP. Therefore, selenium-enrichment can improve nutritional quality of Rhodopseudomonas palustris.

selenium-enrichment；Rhodopseudomonas palustris；nutritional component；evaluation

TS202.3；Q939.112

A

1002-6630(2010)23-0253-05

2010-08-28

江蘇省科學技術廳高技術研究計劃項目(BG2005326)

楊啟銀(1951—)，男，副教授，主要從事微生物應用和微生物制劑研究。E-mail：yangqiyin@163.com