一株黃色短桿菌基因工程菌株的構(gòu)建及其L-纈氨酸積累

徐大慶，譚延振，繆 銘，王小元,*

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

一株黃色短桿菌基因工程菌株的構(gòu)建及其L-纈氨酸積累

徐大慶1,2，譚延振1，繆 銘1，王小元1,*

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

從谷氨酸棒桿菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032中克隆出L-纈氨酸合成途徑上的限速酶——乙酰羥酸合酶編碼基因ilvBN。對(duì)ilvBN進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得其抗反饋抑制突變型ilvBNr。以大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭表達(dá)載體pDXW-10為基礎(chǔ)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pDXW-10-ilvBNr，并轉(zhuǎn)化野生型黃色短桿菌B. flavum ATCC14067，獲得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在野生型菌株發(fā)酵液中檢測(cè)不到L-纈氨酸積累，而工程菌株發(fā)酵液中L-纈氨酸積累達(dá)5.0g/L。

乙酰羥酸合酶；抗反饋抑制；黃色短桿菌；發(fā)酵；L-纈氨酸

L-纈氨酸屬于中性氨基酸，與L-異亮氨酸、L-亮氨酸一起稱為支鏈氨基酸，是人體必需的氨基酸之一。L-纈氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等領(lǐng)域。工業(yè)上主要是通過(guò)應(yīng)用棒狀桿菌發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)L-纈氨酸，而選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌株是實(shí)現(xiàn)L-纈氨酸高效生產(chǎn)的關(guān)鍵。自Nakayama等[1]首先于1961年選育了氨基酸缺陷型的L-纈氨酸生產(chǎn)菌以來(lái)，人們?cè)诎魻顥U菌產(chǎn)L-纈氨酸誘變育種方面進(jìn)行了大量的研究并取得了顯著的成績(jī)[2]。但傳統(tǒng)的誘變育種方式工作量大、周期長(zhǎng)，且引起的遺傳變異在染色體上是隨機(jī)分配的，一些與氨基酸生物合成無(wú)直接關(guān)聯(lián)的區(qū)域也會(huì)被突變，因此可能會(huì)對(duì)細(xì)胞生理產(chǎn)生不可預(yù)知的負(fù)面效應(yīng)。代謝工程是在對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上采用基因工程技術(shù)定向改造細(xì)胞代謝系統(tǒng)以提高產(chǎn)物得率或改進(jìn)細(xì)胞性能[3]。由于關(guān)于谷氨酸棒狀桿菌生理學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)知識(shí)的大量累積[4-5]，基于理性設(shè)計(jì)的代謝工程育種正在成為氨基酸高產(chǎn)菌株選育的主要方式[6]。

雖然國(guó)內(nèi)選育的L-纈氨酸生產(chǎn)菌種較多，但它們均是通過(guò)隨機(jī)誘變和定向篩選的方法獲得的[2]，其產(chǎn)酸水平有待于進(jìn)一步提高。另外，傳統(tǒng)誘變育種獲得的L-纈氨酸高產(chǎn)菌株副生雜酸比較多，尤其是副生L-Leu、L-Ileu、L-Met等，這對(duì)后提取高純度L-Val

造成很大的困難。過(guò)表達(dá)生物合成或降解途徑的限速酶是對(duì)菌株進(jìn)行代謝工程改造的主要策略之一。而由ilvBN基因編碼的乙酰羥酸合酶(AHAS)是棒狀桿菌L-纈氨酸合成途徑上的限速酶。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)獲得AHAS抗反饋抑制突變型編碼基因ilvBNr，然后通過(guò)在黃色短桿菌中過(guò)表達(dá)ilvBNr基因，初步構(gòu)建過(guò)量積累L-纈氨酸的基因工程菌株，并在3L罐發(fā)酵水平上對(duì)其產(chǎn)L-纈氨酸能力進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和表達(dá)載體

大腸桿菌E. coli JM109、谷氨酸棒桿菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032、黃色短桿菌野生型菌株B. flavum ATCC14067以及質(zhì)粒pUC57由本實(shí)驗(yàn)室保藏；E.coli-B. flavum穿梭表達(dá)載體pDXW-10，大小為8351bp，是由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的適合于棒狀桿菌代謝工程研究的組成型表達(dá)載體[7]。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、DNA Marker、ATP、質(zhì)粒小量制備試劑盒 上海生工生物工程服務(wù)有限公司； PrimeSTAR HS DNA聚合酶 大連寶生物公司；引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程服務(wù)有限公司完成；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、基因組提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；酵母粉、胰蛋白胨Oxoid公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌LB培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[8]配制；黃色短桿菌斜面培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基+0.5%葡萄糖；黃色短桿菌種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 25、尿素 1.25、玉米漿 20、KH2PO41、MgSO45，pH 7.0；黃色短桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖150、(NH4)2SO435、玉米漿20、KH2PO41、MgSO41。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和純化

DNA的提取和純化均按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。DNA片段的酶切和連接以及大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化等操作均按文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行；黃色短桿菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行。

1.2.2 PCR擴(kuò)增野生型ilvBN基因

依據(jù)谷氨酸棒桿菌C. glutamicum ATCC13032 ilvBN基因序列[10]，設(shè)計(jì)正向引物ilvBN-F(5＇- actagaattcgaaagg acatgaacgatgaatgtggcagcttctcaac-3＇，下劃線部分為引入EcoRI位點(diǎn))和反向引物ilvBN-R(5＇- actaaagcttttagatc ttggccggagccatggtcttcg-3＇，下劃線部分為引入HindIII位點(diǎn))。以C. glutamicum ATCC13032基因組DNA為模板，ilvBN-F和ilvBN-R 為引物擴(kuò)增ilvBN。反應(yīng)體系為50μL，包括10μL 5×Primer STAR buffer (Mg2+plus)，4μL dNTP 混合物(各2.5mmol/L)，1μL基因組模板，1μL正向引物ilvBN-F(20μmol/L)，1μL反向引物ilvBN-R(20 μmol/L)，0.5μL Prime STAR HS DNA Polymerase。 PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；然后在以下條件下進(jìn)行35 輪循環(huán)：94℃變性30s，60℃退火15s，72℃延伸2.5min；最后一個(gè)循環(huán)完成后72℃再延伸10min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物為2428bp。

1.2.3 ilvBN基因的定點(diǎn)突變

將野生型基因ilvBN的 PCR產(chǎn)物用EcoRI和HindIII雙酶切，連接到同樣用EcoRI和HindIII雙酶切的克隆載體pUC-57上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pUC57-ilvBN。以pUC57-ilvBN為模板，使用攜帶突變位點(diǎn)的一對(duì)完全互補(bǔ)的引物p-F(5＇-g t t c a g g a c g t a g a c g A T G A c Ttttcccgcgtatcagg-3＇)和p-R(5＇-cctgatacgcgggaaa AgTCATcgtctacgtcctgaac-3＇)，其中大寫堿基為引入的突變位點(diǎn)，將ilvN上編碼別構(gòu)中心上3個(gè)氨基酸Gly-Ile-Ile的核苷酸ggaatcatt定點(diǎn)突變成gatgacttt(編碼Asp-Asp-Phe)。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL，包括10μL 5×Primer STAR buffer (Mg2+plus)，4μL dNTP混合物(各2.5mmol/L)，4μL質(zhì)粒pUC57-ilvBN(100ng/μL)模板，1μL正向引物p-F(20μmol/L)，1μL反向引物p-R (20μmol/L)，0.5μL Prime STAR HS DNA Polymerase。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；然后在以下條件下進(jìn)行30 輪循環(huán)：94℃變性30s，60℃退火15s，72℃延伸5.5min；72℃再延伸10min；10℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物直接用1μL DpnI內(nèi)切酶37℃消化1h。取20μL消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑選轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)繁培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測(cè)序，突變的重組質(zhì)粒命名為pUC57-ilvBNr。

1.2.4 重組質(zhì)粒pDXW-10-ilvBNr的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

以質(zhì)粒pUC57-ilvBNrDNA為模板，擴(kuò)增突變型基因ilvBNr，擴(kuò)增引物及條件同1.2.2節(jié)。將ilvBNr和ilvBN PCR產(chǎn)物分別用EcoRI和HindIII雙酶切，分別連接到同樣用EcoRI和HindIII雙酶切的E. coli-B. flavum穿梭表達(dá)載體pDXW-10上，構(gòu)建的重組質(zhì)粒大小都為10717 bp，分別命名為pDXW-10-ilvBNr和pDXW-10-ilvBN。重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化黃色短桿菌B. flavum ATCC14067，構(gòu)建成工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr和ATCC14067/pDXW-10-ilvBN。

1.2.5 工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr的3L罐發(fā)酵

種子液培養(yǎng)：挑一滿環(huán)新鮮斜面上的菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30℃、250r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期。

上罐發(fā)酵：按10%接種量將種子液0.12L接入3L發(fā)酵罐中，初始裝液量1.2L。通風(fēng)量200L/h，攪拌轉(zhuǎn)速控制范圍為200～950r/min，培養(yǎng)溫度30℃。溶氧通過(guò)攪拌自動(dòng)控制在設(shè)定值。菌體生長(zhǎng)初期及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期溶氧控制在50%，穩(wěn)定期溶氧控制在30%。流加25% 氨水和2mol/L HCl 以控制pH7.0。每隔2h取樣測(cè)菌濃度及殘?zhí)?，根?jù)耗糖速率確定補(bǔ)料量，通過(guò)流加質(zhì)量濃度為80g/100mL的葡萄糖使菌體在進(jìn)入衰亡期之前糖質(zhì)量濃度維持在10～15g/L。以ATCC14067/pDXW-10-ilvBN和B.flavum ATCC14067為對(duì)照菌株。

1.2.6 菌濃度測(cè)定

吸取0.1mL的發(fā)酵液，用蒸餾水適當(dāng)稀釋，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定562nm 波長(zhǎng)處的吸光度。

1.2.7 殘?zhí)菧y(cè)定

采用DNS法[11]。

1.2.8 氨基酸含量測(cè)定

采用高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)自動(dòng)柱前衍生化法測(cè)定。采用Agilent公司1200 series色譜儀。色譜柱：Agilent Eclipse-AAA 柱。流動(dòng)相水相(1L)：4.52g 無(wú)水乙酸鈉、200μL 三乙胺、5mL 四氫呋喃、pH7.2；有機(jī)相(1L)：4.52g 無(wú)水乙酸鈉、400mL 甲醇、400mL 乙腈。色譜條件：柱溫40℃，流速1.0mL/min，DAD 檢測(cè)器。

2 結(jié)果與分析

2.1 ilvBN基因的PCR擴(kuò)增及定點(diǎn)突變

為了獲得解除反饋抑制的AHAS[12]，實(shí)驗(yàn)從谷氨酸棒桿菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032基因組上成功地?cái)U(kuò)增出野生型ilvBN，然后通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)將ilvN上編碼別構(gòu)中心上3個(gè)氨基酸Gly-Ile-Ile的核苷酸ggaatcatt定點(diǎn)突變成gatgacttt(編碼Asp-Asp-Phe)(圖1)，成功獲得了抗反饋抑制的突變型基因ilvBNr。

圖1 ilvBNr基因定點(diǎn)突變位點(diǎn)及其上下游序列測(cè)序圖譜Fig.1 Sequencing map showing the site-directed mutagenesis ofilvBNr

2.2 重組質(zhì)粒ATCC14067/pDXW-10-ilvBN和pDXW-10-ilvBNr的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化黃色短桿菌

黃色短桿菌是工業(yè)上用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的主要菌種之一。通過(guò)16S rDNA雜交分析，發(fā)現(xiàn)土壤棒桿菌的兩個(gè)代表種C. glutamicum與B. flavum親緣關(guān)系非常近[13]。筆者將解除反饋抑制的突變型基因ilvBNr異源轉(zhuǎn)化黃色短桿菌B. flavum ATCC14067。ilvBNr的PCR產(chǎn)物用EcoRI和HindIII 雙酶切，并連接到同樣用EcoRI和HindIII 雙酶切的E. coli-B. flavum穿梭表達(dá)載體pDXW-10上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑選卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒。以重組質(zhì)粒為模板，ilvBN-F和ilvBN-R 為引物擴(kuò)增ilvBNr，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2.4kb，與理論值一致(圖2，泳道2)；用EcoRI單酶切重組質(zhì)粒，獲得大小為10.7kb片段，與理論值一致(圖2，泳道3)。通過(guò)單酶切及PCR驗(yàn)證，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pDXW-10-ilvBNr電轉(zhuǎn)化黃色短桿菌，對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，片段大小為10.7 kb，說(shuō)明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功，獲得工程菌株ATCC14067/ pDXW-10-ilvBNr。同樣方法，成功獲得對(duì)照工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBN。

圖2 重組質(zhì)粒pDXW-10-ilvBNr構(gòu)建結(jié)果及其驗(yàn)證Fig.2 Physical map and single enzymatic digestion based identification of recombinant plasmid pDXW-10-ilvBNr

2.3 工程菌ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr3L罐發(fā)酵水平的L-纈氨酸積累

為了檢測(cè)工程菌ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr產(chǎn)L-纈氨酸的情況，進(jìn)行了3L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間到達(dá)68h后，菌體進(jìn)入衰亡期。選取72h停止發(fā)酵，通過(guò)HPLC方法檢測(cè)發(fā)酵液中各種氨基酸的含量。結(jié)果顯示：在野生型菌株B. flavum ATCC14067發(fā)酵液中未檢測(cè)到L-纈氨酸，工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBN發(fā)酵液中L-纈氨酸產(chǎn)量為2.85g/L，而工程菌株ATCC14067/ pDXW-10-ilvBNr發(fā)酵液中目的產(chǎn)物L(fēng)-纈氨酸產(chǎn)量達(dá)到5.0g/L；另外，相比野生型菌株，工程菌株ATCC14067/ pDXW-10-ilvBN和ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr發(fā)酵液中L-丙氨酸含量都顯著降低，L-異亮氨酸和L-亮氨酸含量顯著提高(表1)；其他氨基酸含量無(wú)顯著變化(數(shù)據(jù)未顯示)。

表1 發(fā)酵液中L-纈氨酸及其代謝相關(guān)氨基酸含量Table 1 Concentrations ofL-valine and its metabolism-related amino acids in fermentation broth of differentB. flavumstrains

3 討 論

3種支鏈氨基酸：L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的生物合成途徑是緊密聯(lián)系的，在棒狀桿菌中它們都以圖3的方式進(jìn)行生物合成。異亮氨酸和纈氨酸是由相同酶催化的兩條平行的合成途徑合成的，而亮氨酸和纈氨酸共用同一前體，是由纈氨酸合成途徑中的一條分支反應(yīng)所合成。 L-纈氨酸是以丙酮酸為底物，通過(guò)四步反應(yīng)轉(zhuǎn)化而成。四步反應(yīng)依次分別由ilvBN基因編碼的乙酰羥酸合酶、ilvC基因編碼的乙酰羥酸異構(gòu)還原酶、ilvD基因編碼的二羥酸脫氫酶和ilvE基因編碼的轉(zhuǎn)氨酶催化[14]。而由ilvBN基因編碼的AHAS是L-纈氨酸合成途徑上的第一個(gè)酶，是限速酶。C. glutamicum的AHAS全酶由兩個(gè)ilvB基因編碼的大亞基(催化亞基)和兩個(gè)ilvN基因編碼的小亞基(調(diào)節(jié)亞基)構(gòu)成。Eggeling等[15]研究發(fā)現(xiàn)：3種支鏈氨基酸都存在的情況下，對(duì)AHAS的最大抑制率約為50%。Elisakova等[12]研究結(jié)果表明：L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸在AHAS上的結(jié)合位點(diǎn)為同一位點(diǎn)，位于小亞基N上。3種支鏈氨基都可以對(duì)AHAS進(jìn)行單獨(dú)的反饋抑制作用。將AHAS小亞基別構(gòu)中心的3個(gè)氨基酸Gly-Ile-Ile(20～22位)定點(diǎn)突變成相應(yīng)的Asp-Asp-Phe，能夠完全解除3種支鏈氨基酸對(duì)AHAS的反饋抑制作用。本實(shí)驗(yàn)獲得了一株過(guò)量積累L-纈氨酸的黃色短桿菌基因工程菌株ATCC14067/ pDXW-10-ilvBNr，其產(chǎn)量的提高是通過(guò)異源過(guò)表達(dá)谷氨酸棒桿菌ilvBN基因的抗反饋突變型實(shí)現(xiàn)的。在野生型菌株中，AHAS除在活性水平上受反饋抑制外，在合成水平還受到其3個(gè)末端產(chǎn)物：L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的多價(jià)阻遏[16]，使其不能有效積累L-纈氨酸。在工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBN中，使用組成型表達(dá)載體pDXW-10表達(dá)野生型ilvBN，解除了AHAS合成水平的多價(jià)阻遏作用，使其能大量積累L-纈氨酸。而在工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr中，同時(shí)解除了AHAS合成水平的多價(jià)阻遏作用及活性水平的反饋抑制作用，使其L-纈氨酸的積累能力進(jìn)一步大幅度提高。

圖3 谷氨酸棒桿菌中與L-纈氨酸生物合成相關(guān)的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways related toL-valine biosynthesis inC. glutamicum

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，工程菌株發(fā)酵液中除了L-纈氨酸產(chǎn)量大幅度提高外，L-丙氨酸含量顯著降低，這可能是由于過(guò)表達(dá)抗反饋抑制的AHAS使更多的丙酮酸用于L-纈氨酸的生物合成，進(jìn)而減少了用于L-丙氨酸轉(zhuǎn)化的丙酮酸的量造成的?？梢?jiàn)，在工程菌株中，丙酮酸的供給是相對(duì)不足的，增加前體物質(zhì)丙酮酸供給是提高L-纈氨酸產(chǎn)量的另一關(guān)鍵。另外，工程菌發(fā)酵液中L-異亮氨酸和L-亮氨酸含量也都有顯著提高，這表明由過(guò)表達(dá)AHAS而增加的碳流一部分被用于L-異亮氨酸和L-亮氨酸的過(guò)量合成。因此，在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了最終獲得高產(chǎn)L-纈氨酸的基因工程菌株，后期的代謝工程改造工作可以從如下兩個(gè)大的方面開(kāi)展研究： 1)通過(guò)基因工程技術(shù)降低丙酮酸到乙酰CoA的代謝流，使糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸大量積累，為L(zhǎng)-纈氨酸的生物合成提供充足的底物。乙酰CoA合成量的減少而影響到菌體生長(zhǎng)，可以通過(guò)在培養(yǎng)基中添加乙酸鈉來(lái)解決[17]；2)降

低蘇氨酸到2-酮丁酸的代謝流以減少L-異亮氨酸的合成，降低2-酮異戊酸到2-異丙基蘋果酸及酮泛解酸的代謝流以減少L-亮氨酸及D-泛酸的合成，降低丙酮酸到L-丙氨酸的代謝流以減少L-丙氨酸的合成，這些都能使更多的碳流用于L-纈氨酸的生物合成。

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Construction and L-valine Accumulation of a Genetic Engineering Brevibacterium flavum Strain

XU Da-qing1,2， TAN Yan-zhen1， MIAO Ming1， WANG Xiao-yuan1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

As a rate-limiting enzyme for L-valine biosynthesis, the ilvBN gene encoding acetyl-carboxylic acid synthase (AHAS) from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was amplified by PCR, followed by site-direct mutagenesis to obtain an ilvBNrgene, the anti-feedback inhibition gene of ilvBN. The ilvBNrgene inserted into E. coli-Brevibacterium flavum shuttle expression vector pDXW-10 to construct a recombinant plasmid pDXW-10-ilvBNr, which was subsequently transformed into B. flavum ATCC14067, producing a genetic engineering strain ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr. The fermentation experiments conducted in a 3 L fermentor showed that no L-valine accumulation was detected in the fermentation broth of the original strain, while an L-valine accumulation of 5.0 g/L was observed in the fermentation broth of the constructed engineering strain.

acetyl-carboxylic acid synthase；anti-feedback inhibition；Brevibacterium flavum；fermentation；L-valine

Q851

A

1002-6630(2010)23-0262-05

2010-04-15

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA02Z229；2007AA02Z230)

徐大慶(1972—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锎x工程。E-mail：daqingxu@yahoo.com.cn

*通信作者：王小元(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩拔⑸锎x工程。E-mail：xiaoyuanwang@hotmail.com