魷魚肝臟蛋白水解液及ACE抑制肽的制備

謝 超，林 琳，裘曉華，林婭萍

(浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000)

魷魚肝臟蛋白水解液及ACE抑制肽的制備

謝 超，林 琳，裘曉華，林婭萍

(浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000)

為高效利用魷魚及其下腳料肝臟蛋白水解物，采用酶解技術(shù)和凝膠過濾分離等技術(shù)對魷魚肝臟蛋白水解液中抑制肽進(jìn)行研究。結(jié)果表明：胃蛋白酶為魷魚肝臟蛋白水解的最佳酶類，同時(shí)以水解度和ACE抑制活性為指標(biāo)，得出胃蛋白酶水解的最佳條件：在36℃條件下酶解22h，酶與底物的質(zhì)量比2%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%。經(jīng)過上述條件處理的水解液再經(jīng)超濾處理(截留分子質(zhì)量為20kD)后，用Sephadex G-50進(jìn)行分離，洗脫得到5個(gè)峰，其中組分B的ACE抑制活性最高，其半抑制濃度(IC50)達(dá)到1.80mg/mL。

魷魚肝臟蛋白；酶解液；ACE抑制肽

魷魚加工過程中有約占魷魚體質(zhì)量30%的頭、足、肝臟及表皮等廢棄物產(chǎn)生。對于這些廢棄物，一般的處理方法是加工魚粉，或者掩埋，這不但是對漁業(yè)資源的巨大浪費(fèi)，而且還存在著環(huán)境污染的問題[1-3]。在國外，如西班牙和日本對于魷魚肝臟的利用采用自身酶解發(fā)酵法生產(chǎn)魷溶漿、魷魚粉等作為魚類飼料。在國內(nèi)魷魚肝臟的利用和研究還有比較大的發(fā)展空間，目前僅有魷魚肝臟干粉的加工，并且是用作飼料，技術(shù)水平不高[4-5]。

目前，已有從魷魚皮制備膠原蛋白活性肽，產(chǎn)品具有很強(qiáng)的生物活性，可用于制備抗氧化、降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化的保健食品或藥品，但均是從魷魚皮中提出來的。通常ACE抑制肽的生產(chǎn)方法有以下幾種：一是從生物體中分離各類天然ACE抑制肽；二是通過酶制劑水解蛋白質(zhì)獲得；三是利用分子生物技術(shù)合成抑制肽。當(dāng)前水解蛋白質(zhì)生成ACE抑制肽因其安全性高、水解過程容易受控制、并且水解條件比較溫和等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在ACE抑制肽的生產(chǎn)中[6-7]。同時(shí)水解酶類是酶解法生產(chǎn)抑制肽的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前廣泛使用的蛋白酶類有堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。本研究的目的是從廢棄的魷魚肝臟中提取蛋白質(zhì)和生物活性肽——ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)抑制肽，制備消化吸收效率更高的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，而且制備的生物活性肽還可應(yīng)用于疾病的防治，用于食品與醫(yī)藥行業(yè)，為維護(hù)人類的健康作貢獻(xiàn)[8-14]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

冷凍秘魯魷魚(解凍后取其肝臟，－18℃冷凍保存)市購。胃蛋白酶(1000IU/g)、中性蛋白酶(100000IU/g)、木瓜蛋白酶(1000000IU/g)、風(fēng)味蛋白酶(1000IU/g)、復(fù)合蛋白酶(10000IU/g)、胰蛋白酶(2000IU/g) 廣西南寧龐博生物有限公司。CF16RX高速冷凍離心機(jī)、U-2800紫外檢測儀、AL104分析天平、LC600反相高效液相色譜儀 日本日立公司、Labscale TFF超濾裝置 美國伯樂公司。

1.2 魷魚肝臟蛋白的制備

將適量魷魚冷凍肝臟按照質(zhì)量比1:2加水，充入氮?dú)?0min，并加入0.1%的L-抗壞血酸-6-棕櫚酸酯防止其氧化，再將其放入高壓鍋中(121℃，0.2MPa)加熱20min，然后在6000r/min條件下離心25min左右，去掉最上層的魚油層。用丙酮洗滌，真空干燥后既得脫脂魷魚肝臟蛋白。

1.3ACE抑制活性的測定

ACE抑制活性的測定借鑒Cushman等的方法[15]。首先用含608mmol/L NaCl的0.2mol/L硼酸鹽緩沖液(pH8.3)將底物Hip-His-Leu配成7.6mmol/L的溶液。然后在0.5mL的Eppendof管中分別加入5μL樣品或硼酸緩沖液和15μL ACE(60mU/mL)在37℃靜置5min，再加入25μL底物反應(yīng)25min，最后加入5μL 0.1%三氟乙酸(TFA)溶液，終止反應(yīng)后自然冷卻。最后應(yīng)用反相高效液相色譜測定ACE與底物反應(yīng)生成馬尿酸的量，以此判斷對ACE的抑制活性。ACE活性抑制50%時(shí)所需要的抑制劑的濃度稱為IC50。

1.4 魷魚肝臟蛋白的水解

1.4.1 蛋白水解液標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 蛋白水解液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein

取完全酶解液0.2～2mL于比色管中，用蒸餾水稀釋至4mL，加pH8的磷酸鹽緩沖液1mL，茚三酮溶液1mL，沸水浴加熱15min，冷卻，用蒸餾水稀釋至25mL。360nm波長處測吸光度。以蒸餾水為參比，另取25mg蛋白質(zhì)，加水25mL，振蕩均勻后過濾，取相應(yīng)體積的濾液，按上述方法測吸光度，其與相同體積樣品的吸光度之差對蛋白質(zhì)含量做工作曲線，見圖1。由圖1可以看出，蛋白質(zhì)含量與吸光度呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.2308x－0.2931，相關(guān)性R2＝0.9895。

1.4.2 魷魚肝臟蛋白酶解液水解度的測定

首先取水解后滅酶的水解液1mL，用蒸餾水稀釋至100mL，經(jīng)過濾，取濾液2.5mL，再加水至4mL，加pH8緩沖溶液1mL，茚三酮1mL，以沸水浴加熱15min，冷卻后再用蒸餾水稀釋至25mL，用以于280nm波長處測吸光度。

以蒸餾水做對比，取相同濃度未水解蛋白溶液2mL，按以上方法測吸光度，以二者吸光度之差從工作曲線上查蛋白質(zhì)含量，計(jì)算水解度(DH)：

式中：A為查表得蛋白質(zhì)質(zhì)量/mg；m為稱樣質(zhì)量/g；V1為水解液總體積/mL；V2為顯色時(shí)所用稀釋液體積/mL。

1.4.3 魷魚肝臟蛋白酶制劑的篩選

用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解比較。在相同的魷魚肝臟蛋白溶液中加入2%的各種蛋白酶制劑，維持恒溫，在各種酶最適合的pH值條件下水解22h。酶解后將溶液pH值調(diào)為中性，離心過濾，上清液即為魷魚肝臟蛋白酶解液。測定酶解液的ACE抑制活性，根據(jù)抑制ACE活性的來確定所用蛋白酶制劑。

1.4.4 胃蛋白酶酶解條件的優(yōu)化研究

1.4.4.1 酶與底物質(zhì)量比的優(yōu)化

在溫度37℃、pH2.0、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%、酶與底物的質(zhì)量比分別為0%、0.5%、1.0%、2%、5%條件下水解22h，測定酶解液的水解度和對ACE的抑制活性。

1.4.4.2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

在溫度36℃、pH2.0、酶與底物質(zhì)量比2%、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在1%、2.5%、5.0%、7.5%、10%條件下水解22h，測定酶解液的水解度和對ACE的抑制活性。

1.4.4.3 酶解時(shí)間的優(yōu)化

在溫度36℃、pH2.0、以酶與底物質(zhì)量比2%、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的條件下，處理時(shí)間分別為2、7、12、17、22、27、32h，測定酶解液的水解度和對ACE的抑制活性。

1.5 魷魚肝臟蛋白酶解液的制備

將脫脂肝臟蛋白，按照體積比1:2的比例加入去離子水，用胃蛋白酶酶解22h，條件為溫度36℃、pH2.0、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%。隨后在90℃條件保持20min終止酶解，冷卻后以超濾膜過濾除去分子質(zhì)量高于20kD的產(chǎn)物。收集水解產(chǎn)物，以4℃條件保存待用。

1.6 ACE抑制肽的分離及其ACE抑制活性分析

1.6.1 魷魚肝臟蛋白酶解液的超濾處理

超濾裝置連接好后，用恒流泵將魷魚肝臟蛋白的酶解液在室溫下壓入截留分子質(zhì)量20kD的濾膜，收集小分子濾液。截留液用蒸餾水適當(dāng)稀釋后繼續(xù)超濾，將合并收集的超濾液進(jìn)行冷凍干燥待用。

1.6.2 用Sephadex G-50分離ACE抑制肽

取超濾后凍干樣品溶解，用Sephadex G-50分離ACE抑制肽，并測定各肽的ACE的抑制活性。將適量超濾凍干樣品配成溶液，用Sephadex G-50凝膠柱對其進(jìn)行分離，再用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速24滴/min，在波長280nm處測定各肽的ACE的抑制活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 魷魚肝臟脫脂蛋白的制備結(jié)果

將魷魚肝臟中的魚油分離后，魷魚肝臟蛋白中還含有一定量的脂肪。脂肪的存在會(huì)對產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味產(chǎn)生不良影響，且易造成水解液渾濁。為了消除這些不良影響，實(shí)驗(yàn)采取丙酮浸提法。經(jīng)過丙酮浸提3～5次后，得到脫脂后的魷魚肝臟蛋白。計(jì)算得率約為18%。

2.2 蛋白酶制劑的篩選

將各種蛋白酶處理魷魚肝臟蛋白。檢測各種酶制劑所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性，結(jié)果見表1。

表1 各種酶解液的ACE抑制活性Table 1 Effect of protease type on the ACE inhibitory activity of the hydrolysate

從表1可以看出，用胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶酶解后的溶液ACE抑制活性較高。通過測定這3種酶解液的水解度，分別為胃蛋白酶酶解液24.6%、復(fù)合蛋白酶酶解液20.8%、中性蛋白酶酶解液22.2%。根據(jù)ACE抑制活性和水解度的大小，選擇酶解液水解度最高、ACE抑制活性較高的胃蛋白酶作為生產(chǎn)酶制劑。

2.3 胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白的優(yōu)化

2.3.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對蛋白酶解效果的影響

圖2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解度和ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of the hydrolysate

當(dāng)胃蛋白酶底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～2.5%時(shí)，其值增加有利于反應(yīng)速度的升高，導(dǎo)致水解度的上升(圖2)。但當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.5%～10%時(shí)，伴隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，蛋白水解度反而呈下降的趨勢?？赡苁怯捎诘孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)較大時(shí)，在不斷受熱情況下，蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生交聯(lián)聚合現(xiàn)象。導(dǎo)致蛋白酶分子與底物蛋白分子之間的接觸機(jī)會(huì)減少，影響酶解反應(yīng)的速度，從而導(dǎo)致水解度下降。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化對抑制ACE活性的影響變化不大，因此，通過綜合考慮選用2.5%為蛋白水酶解反應(yīng)的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間對蛋白酶解效果的影響

圖3 酶解時(shí)間對水解度和ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of hydrolysis duration on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of the hydrolysate

由圖3可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在2～22h時(shí)，蛋白水解度隨著時(shí)間的延長而顯著增加，但在22h后，蛋白水解度隨反應(yīng)時(shí)間的延長變化細(xì)微。同時(shí)，通過研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時(shí)間的延長對抑制ACE活性的影響變化不大，綜合考慮上述兩個(gè)因素確定選用酶解時(shí)間為22h。

2.3.3 酶與底物質(zhì)量比對反應(yīng)效果的影響

當(dāng)酶與底物質(zhì)量比在0～2%時(shí)，蛋白水解液的水解度呈上升趨勢，由圖4可以看出，當(dāng)?shù)鞍酌讣尤肓枯^低時(shí)，水解度增長速度較快。當(dāng)酶與底物質(zhì)量比達(dá)2%～5%時(shí)，水解度變化不是很明顯，由于酶加入量較高

時(shí)，它與蛋白質(zhì)分子肽鏈的接觸機(jī)率就越多，導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物肽的可能性增加。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)得出，酶與底物比的變化對抑制ACE活性的影響變化也不大，綜合考慮各方面的因素，研究選用2%作為酶與底物的質(zhì)量比。

圖4 酶與底物比對水解度和ACE抑制活性的影響Fig.4 Effect of enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of the hydrolysate

2.4ACE抑制肽的初步分離

采用凝膠過濾法分離魷魚肝臟蛋白酶解的產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)使用葡聚糖凝膠。葡聚糖凝膠是由一定平均分子質(zhì)量的葡聚糖(右旋糖)和甘油基以醚橋(—O—CH2—CH—CH2—O)形式相互交聯(lián)形成的三維空洞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過控制交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷和葡聚糖的配比以及交聯(lián)時(shí)的反應(yīng)條件可控制交聯(lián)度而獲得具有不同網(wǎng)眼的凝膠，網(wǎng)眼的大小決定了被分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍。

Sephadex G-50的分離范圍是3～10kD。用Sephadex G-50初步分離魷魚肝臟蛋白酶解液，用30%的甲醇作為洗脫液，以24滴/min的恒速進(jìn)行洗脫，在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿著凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。實(shí)驗(yàn)中，有5個(gè)峰被檢測到，如圖5所示峰值A(chǔ)、B、C、D、E。對每個(gè)峰分別收集、真空濃縮、冷凍干燥后測定其ACE抑制活性。

圖5 酶解液在Sephadex G-50上的洗脫圖Fig.5 Sephadex G-50 fractionation of the target hydrolysate

表2 Sephadex G-50初步分離各片斷ACE抑制活性和回收率Table 2 IC50values and recoveries of Sephadex G-50 fractions of the target hydrolysate

如表2所示，第A、B、C區(qū)洗脫下來的蛋白具有ACE抑制活性，其IC50分別為2.26、1.80、5.08mg/mL。結(jié)果表明分子質(zhì)量較大的多肽具有較好的ACE抑制活性。

3 結(jié) 論

3.1 胃蛋白酶為魷魚肝臟蛋白水解的最佳酶類，其水解的最優(yōu)條件為在36℃酶解22h、酶與底物的質(zhì)量比2%、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，此時(shí)酶解效果最好。3.2經(jīng)過上述條件處理后的水解液經(jīng)超濾處理(截留分子質(zhì)量為20kD)后，用Sephadex G-50進(jìn)行分離，洗脫得到5個(gè)峰，檢測各峰值的抑制活性，其中組分B的ACE抑制活性最高，其半抑制濃度(IC50)達(dá)到1.80mg/mL。

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Preparation and Separation of ACE Inhibitory Peptides from Hydrolyzed Squid Liver Protein

XIE Chao，LIN Lin，QIU Xiao-hua，LIN Ya-ping
(College of Food and Pharmacology, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000, China)

Squid liver as a byproduct of squid processing was processed into protein. The protein was enzymatically hydrolyzed and ACE inhibitory peptides were obtained from the hydrolysate after ultrafiltration and Sephadex G-50 fractionation. Pepsin was found optimal for the hydrolysis of squid liver protein. The optimal pepsin hydrolysis conditions for both higher degree of hydrolysis and ACE inhibitory ratio were as follows: substrate concentration 2.5%; enzyme/substrate ratio 2%; and temperature 36 ℃ for a hydrolysis duration of 22 h. The smaller molecular weight fractions after ultrafiltration through a membrane with 20 kD molecular weight cutoff (MWCO) were fractionized on Sephadex G-50 column, resulting in five elution peaks. Among them, fraction (peak) B presented the highest ACE inhibitory activity, with an IC50of 1.80 mg/mL.

squid liver protein；hydrolysate；ACE inhibitory peptides

R151.1

A

1002-6630(2010)18-0139-04

2010-06-23

浙江省重大科技專項(xiàng)(2009C12025)；浙江省公益基金項(xiàng)目(2009C22023)；2009年舟山市重大項(xiàng)目(092033)

謝超(1975—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：xc750205@163.com