蔡廣霞，陳季旺,*，王元鳳，魏新林

(1.武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

蘆筍葉速溶茶酶法輔助處理工藝研究

蔡廣霞1，陳季旺1,*，王元鳳2，魏新林2

(1.武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

為改善蘆筍葉速溶茶加工工藝，添加中性蛋白酶、纖維素酶輔助浸提蘆筍葉茶，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化兩種酶復(fù)合浸提的工藝條件。結(jié)果顯示：只添加一種酶時(shí)，纖維素酶與底物比為12U/g、時(shí)間30～60min；中性蛋白酶與底物比為6AU/kg、時(shí)間60～90min，黃酮提取率、氨基酸含量均較高。復(fù)合酶浸提較佳工藝條件為：纖維素酶和中性蛋白酶與底物比分別為10.56U/g和2.64AU/kg，提取時(shí)間50min。在該工藝條件下，蘆筍葉黃酮提取率為95.8%，提取液中氨基酸含量為20.1mg/g。

蘆筍；速溶茶；中性蛋白酶；纖維素酶；黃酮

Abstract：In order to modify the extraction technology of asparagus instant tea, neutral protease and cellulase was used to improve the extraction efficiency during the extraction of asparagus. The optimal extraction parameters were explored using orthogonal array design. Single factor experimental results indicated that the extraction rate of flavonoids and amino acid content exhibited an obvious improvement under the following conditions:cellulase-to-substrate ratio of 12 U/g and enzymatic hydrolysis time of 30 to 60 min; neutral protease-substrate ratio of 6 AU/kg and enzymatic hydrolysis time of 60 to 90 min. Moreover,the optimal parameters for hydrolysis with compound enzymes were cellulase-to-substrate ratio of 10.56 U/g, neutral proteaseto-substrate ratio of 2.64 AU/kg and enzymatic hydrolysis time of 50 min. The extraction rate of flavonoids was 95.8%, and amino acid content was 20.1 mg/g under these optimal conditions for compound enzymes.

Key words：asparagus；instant tea；neutral protease；cellulase；flavonoids

蘆筍，又稱石刁柏，是百合科天門冬屬多年生草本植物[1]，營養(yǎng)豐富。除蛋白質(zhì)外，還富含維生素、無機(jī)鹽、微量元素以及天冬酰胺、天冬氨酸、黃酮類物質(zhì)等藥用成分[2-4]。我國是世界上最大的蘆筍種植基地，種植面積和產(chǎn)量約占全世界的40%。目前，蘆筍主要用于加工鮮切蘆筍、蘆筍罐頭以及利用其下腳料生產(chǎn)蘆筍汁、蘆筍醋飲料等[5-7]。在采收蔬菜筍后殘留的占植株質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%～80%的枝葉被當(dāng)作廢棄物丟掉，這些廢棄物中有些營養(yǎng)成分的含量甚至高于蔬菜筍，這樣不僅浪費(fèi)了資源，而且枝葉易腐敗發(fā)臭，造成了環(huán)境污染，因此，開發(fā)蘆筍葉速溶茶有利于合理利用蘆筍資源，提高蘆筍加工的附價(jià)值。

速溶茶具有飲用方便、相對(duì)體積(或質(zhì)量)小、易保存運(yùn)輸、不含有害物質(zhì)、含有傳統(tǒng)茶葉中能夠進(jìn)入茶湯的營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)的特點(diǎn)，因此，近年來在國內(nèi)外，特別是在歐美國家頗為流行，是一種很有前景的飲品[8]。速溶茶的加工方法主要有酶法和微波法等，應(yīng)用較多的外源酶主要有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等[9]。王元鳳等[10]研究外源酶應(yīng)用于速溶茶、茶飲料加工中，其目的是為了提高產(chǎn)品的冷溶性、產(chǎn)品得率或減少形成速溶茶粉末的泡沫。王登良等[11]研究表明纖維素酶處理茶葉后，水浸出物、多酚、水溶性糖、黃酮的含量均明顯提高。目前，酶法輔助處理在蘆筍葉速溶茶加工中的應(yīng)用還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究單獨(dú)采用纖維素酶和中性蛋白酶以及這兩種酶復(fù)合輔助處理蘆筍葉速溶茶的新工藝，并對(duì)復(fù)合酶的較佳工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，擬為蘆筍葉速溶茶的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FZ102微型植物試樣粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；Q/BKYY31-2000熱風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；SHB-Ⅱ循環(huán)水式多用真空泵、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英裕予華儀器廠。

作者簡介： 向澤瓊，女，重慶豐都人，重慶市豐都縣第一小學(xué)校，教師，本科學(xué)歷，研究方向：中小學(xué)體育與德育。

1.2 儀器與設(shè)備

蘆筍葉粉(水分含量9.1%，黃酮含量25.68‰) 自制；纖維素酶(最適溫度50℃，最適pH4.8，酶活力2000U/mL，配成4U/mL酶液) 寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶(最適溫度50℃，最適pH7.0，酶活力1000AU/kg，配成0.002AU/mL酶液) Novo Nordisk公司；三氯化鋁、二甲基四亞砜 國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠；茚三酮 天津科密歐化學(xué)試劑公司；乙酸鋰上海風(fēng)舜精細(xì)化工有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 蘆筍葉速溶茶生產(chǎn)工藝

工藝流程：蘆筍葉→殺青→粉碎過篩→酶法輔助處理→過濾→調(diào)配、增香→均質(zhì)→真空濃縮→噴霧干燥→蘆筍葉速溶茶。

操作要點(diǎn)：1)殺青：蘆筍葉經(jīng)210℃殺青處理后，30℃熱風(fēng)烘干；2)粉碎過篩：用微型植物粉碎機(jī)把烘干的蘆筍葉粉碎，過60目篩；3)酶法輔助處理：稱取0.5g蘆筍葉粉，用20mL去離子水浸泡，加入纖維素酶或中性蛋白酶或二者的復(fù)合酶進(jìn)行輔助處理。將中性蛋白酶酶解液在pH9.0條件下滅酶，測定黃酮提取率和氨基酸含量。纖維素酶解液在pH7.0條件下滅酶，測定黃酮提取率。

1.3.2 測定方法

水分：參照GB 5009.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品中水分的測定》中的直接干燥法；游離氨基酸含量：參照GB 8314—1987《茶：游離氨基酸總量測定》。

1.3.3 黃酮含量測定

采用三氯化鋁比色法。精確稱取樣品2 g，加水80mL，于沸水浴中提取30min，過濾，加蒸餾水定容至100mL，搖勻。吸取試液0.5mL，加1%三氯化鋁溶液定容至10mL，搖勻，靜置10min后比色，用1cm比色皿，于波長420nm處測定吸光度。

有關(guān)資料顯示，我國公眾急救知識(shí)普及率不超過1%，其中，大學(xué)生接受急救培訓(xùn)的大多數(shù)為醫(yī)學(xué)類的學(xué)生。歐美、日韓等國家大力推行應(yīng)急救護(hù)培訓(xùn)，其中，美國公眾基本急救技術(shù)普及率達(dá)89.95%，新加坡衛(wèi)生救護(hù)知識(shí)培訓(xùn)普及率達(dá)20%。我國開展公眾急救知識(shí)培訓(xùn)起步較晚，存在著實(shí)施及資金雙重困難。在我國人口基數(shù)大、幅員遼闊的國情下，在不同區(qū)域和不同居民群體中進(jìn)行急救知識(shí)的普及，也存在著許多不同的特性，我國居民急救能力的培養(yǎng)仍然面臨著較大的挑戰(zhàn)。

法拉利812 Superfast上下車的便利程度不亞于一輛普通的大眾高爾夫，并且駕駛席側(cè)車窗可在120公里/小時(shí)的車速下保持開啟而不會(huì)產(chǎn)生刺耳的噪音。不僅如此，當(dāng)前車速和擋位等信息還可以實(shí)時(shí)呈現(xiàn)在副駕駛的眼前，這無疑為駕駛員和副駕駛之間的交流提供了充分的素材。

1.3.4 單酶處理試驗(yàn)

在單酶試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行復(fù)合酶正交試驗(yàn)，選用L9(34)正交表，考察：1)酶的總添加量1、1.5、2mL；2)酶解時(shí)間30、50、70min；3)復(fù)配比1:2、1:1、2:1(即加入纖維素酶、中性蛋白酶酶液的體積比)對(duì)黃酮提取率、氨基酸含量的影響。試驗(yàn)因素水平見表1。

1.3.5 復(fù)合酶處理試驗(yàn)

稱取0.5g過60目篩蘆筍葉粉，放入酶反應(yīng)器中，進(jìn)行：1)1mL(酶與底物比4AU/kg，下同)、1.5mL(6AU/kg)、2mL(8AU/kg)中性蛋白酶酶液分別在30、60、90、120、150min條件下浸提試驗(yàn)；2)1mL(8U/g)、1.5mL(12U/g)、2mL(16U/g)纖維素酶酶液分別在30、60、90、120、150min條件下浸提試驗(yàn)。

式中：320表示當(dāng)吸光度等于1.0時(shí)，相當(dāng)于320 μg黃酮；L1為定容體積/mL；L2為吸取試樣體積/mL；M為試樣質(zhì)量/g；m為試樣干基質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

表1 復(fù)合酶處理正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 中性蛋白酶對(duì)蘆筍葉浸提效果的影響

圖1 中性蛋白酶對(duì)蘆筍葉黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of neutral protease amount on the extraction yield of flavonoids from asparagus leaves

試驗(yàn)中有兩個(gè)指標(biāo)，根據(jù)各個(gè)指標(biāo)的重要程度，采用綜合評(píng)分法[15]得出試驗(yàn)的總指標(biāo)，再根據(jù)這個(gè)指標(biāo)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果作進(jìn)一步分析。黃酮提取率、氨基酸含量值可直接轉(zhuǎn)化為數(shù)量指標(biāo)。根據(jù)實(shí)際要求，黃酮提取率、氨基酸含量的權(quán)重分別取0.8和0.2，每次試驗(yàn)的綜合分?jǐn)?shù)=黃酮提取率×0.8+氨基酸含量×0.2。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，由極差分析的結(jié)果可知RB＞RA＞RC，因素從主到次的順序?yàn)椋築酶解時(shí)間、A酶添加量、C復(fù)配比，優(yōu)方案定為A3B2C3。

2017年七月，全國金融會(huì)議召開，會(huì)議提出了“服務(wù)實(shí)體經(jīng)濟(jì)，防控金融風(fēng)險(xiǎn)，深化金融改革”的金融改革目標(biāo)。針對(duì)當(dāng)前資本市場資本“空轉(zhuǎn)”，民營經(jīng)濟(jì)和普通群眾杠桿日益增加的現(xiàn)狀，提出了包括“一行三會(huì)”在內(nèi)的監(jiān)管主體參與及制度方式，控制資本的肆意流動(dòng)，降低經(jīng)濟(jì)“杠桿率”，規(guī)避債務(wù)風(fēng)險(xiǎn)。引“貨幣”、“資本”之水入實(shí)體經(jīng)濟(jì)，引導(dǎo)金融回歸服務(wù)實(shí)體經(jīng)濟(jì)的本質(zhì)。

圖2 中性蛋白酶對(duì)蘆筍葉提取液中氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of neutral protease amount on the amino acid content of asparagus instant tea

由圖2可知，當(dāng)酶與底物比在4～6AU/kg之間時(shí)，隨著酶與底物比的增加，氨基酸含量增加明顯；當(dāng)酶與底物比在6～8AU/kg之間時(shí)，隨著酶與底物比的增加，氨基酸含量增幅減緩。由圖2還可看出，隨著時(shí)間增加，氨基酸含量迅速增加，到90min時(shí)達(dá)到最高，然后增幅趨于平緩。蘆筍葉中蛋白質(zhì)大部分是不可溶的，中性蛋白酶可將蛋白質(zhì)水解為氨基酸。綜合考慮，選擇中性蛋白酶浸提時(shí)的酶與底物比和時(shí)間分別為6AU/kg和 60～90min。

2.2 纖維素酶對(duì)蘆筍葉浸提效果的影響

圖3 纖維素酶對(duì)蘆筍葉黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of cellulose amount on the extraction rate of flavonoids from asparagus leaves

由圖3可以看出，當(dāng)酶與底物比在8U/g到12U/g之間時(shí)，隨著酶與底物比的增加，黃酮提取率增加明顯；當(dāng)酶與底物比在12U/g到16U/g之間時(shí)，隨著酶與底物比的增加，黃酮提取率反而下降。蘆筍葉細(xì)胞壁上的纖維素受到纖維素酶的作用發(fā)生降解，胞內(nèi)有效成分容易浸出進(jìn)入提取液中，利于黃酮浸出，但過高的酶與底物比對(duì)纖維素酶的水解作用產(chǎn)生抑制，使酶的活力降低[11-14]。從圖3還可以看出，在30～90min之間，黃酮提取率稍有增加，當(dāng)時(shí)間大于90min時(shí)，黃酮提取率稍有下降，可能是蘆筍葉提取液中的黃酮與氧氣接觸而被破壞。因此，選擇纖維素酶浸提時(shí)的酶與底物比和酶解時(shí)間為分別12U/g和30～60min。

2.3 復(fù)合酶作用對(duì)蘆筍葉浸提效果的影響

由圖1可知，當(dāng)酶與底物比在4～6AU/kg之間時(shí)，隨著酶與底物比的增加，黃酮提取率增加明顯；當(dāng)酶與底物比在6～8AU/kg之間時(shí)，隨著酶與底物比的增加，黃酮提取率迅速下降。雖然酶與底物比的增加一定程度上可以提高黃酮提取率，但蛋白酶本身也是一種蛋白質(zhì)，容易與茶多酚類物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合及沉淀作用，過高的酶與底物比促進(jìn)沉淀的產(chǎn)生影響酶的活力，不利于黃酮的提取[12-14]。由圖1還可看出，隨著時(shí)間延長，黃酮提取率先增后減，在時(shí)間60min時(shí)最高。由于在液固相傳質(zhì)沒有達(dá)到相平衡時(shí)，浸提時(shí)間越長，越能保證浸提時(shí)固相向液相傳質(zhì)，可以提高提取率。但隨著時(shí)間延長，氧氣會(huì)導(dǎo)致黃酮氧化，液相中黃酮含量減少，黃酮提取率有所降低。

表2 復(fù)合酶處理正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3數(shù)據(jù)顯示，酶添加量和時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果影響顯著，復(fù)配比的影響不顯著。綜合考慮，確定復(fù)合酶輔助浸提蘆筍葉速溶茶較佳的工藝條件為纖維素酶和中性蛋白酶酶的總添加量2mL、時(shí)間50min、復(fù)配比2:1，即纖維素酶和中性蛋白酶體積分別為1.32mL和0.66mL，可知此時(shí)酶與底物比為10.56U/g和2.64AU/kg。

二是，引入“中國夢(mèng)”宣傳教育可以提高大學(xué)生的歷史責(zé)任感〔3〕?，F(xiàn)階段，隨著人們生活水平的提高，部分大學(xué)生已經(jīng)養(yǎng)成了浪費(fèi)的習(xí)慣，且缺乏歷史責(zé)任感，不能正確認(rèn)識(shí)自身肩上所承擔(dān)的歷史責(zé)任。面對(duì)此種情況，各個(gè)大學(xué)就需要積極引入“中國夢(mèng)”宣傳教育，通過此項(xiàng)工作，讓大學(xué)生可以正式自身歷史使命，主動(dòng)承擔(dān)民族建設(shè)責(zé)任，從而為“中國夢(mèng)”的實(shí)現(xiàn)貢獻(xiàn)出自身力量。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis for the weighted average of the extraction yield of flavonoids from asparagus leaves and the amino acid content of asparagus instant tea with various extraction conditions

2.4 優(yōu)化條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)以上數(shù)據(jù)處理結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和空白試驗(yàn)，即在纖維素酶與底物比10.56U/g、中性蛋白酶酶與底物比2.64AU/kg、酶解時(shí)間50min條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次取平均值，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，空白試驗(yàn)不加酶液(其他條件同上)進(jìn)行試驗(yàn)。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Verification of optimized conditions for asparagus instant tea extraction

在此工藝條件下浸提蘆筍葉，黃酮提取率為95.8%，提取液中氨基酸含量為20.1mg/g，空白試驗(yàn)結(jié)果為黃酮提取率為78.9%，提取液中氨基酸含量為17.3mg/g。優(yōu)化條件下，黃酮提取率和提取液中氨基酸含量分別是空白試驗(yàn)對(duì)照組的121%和116%倍。由單因素試驗(yàn)可知，中性蛋白酶浸提時(shí)加酶量和時(shí)間分別為6AU/kg、60～90min，黃酮提取率91%～93%，纖維素酶浸提時(shí)加酶量和時(shí)間為分別12U/g和30～60min，黃酮提取率93%～95%，復(fù)合酶處理時(shí)纖維素酶酶與中性蛋白酶底物比分別10.56 U/g、2.64AU/kg，時(shí)間50min，黃酮提取率為95.8%。由此可知為達(dá)相同提取效果，復(fù)合酶處理比單一酶作用時(shí)酶用量減少，作用時(shí)間短，浸提效率高，可節(jié)省提取成本。

長期慢性壓力必然引起腦卒中病人家庭照顧者知覺壓力提高。本次調(diào)查結(jié)果表明：腦卒中病人家庭照顧者知覺壓力處于較高水平，且得分高于國內(nèi)常模，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表3和表4結(jié)果顯示：知覺壓力水平較高者，承受的壓力較大，心理健康水平較低。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黃酮提取率、氨基酸含量為指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)確定的復(fù)合酶輔助浸提的較佳工藝條件為：纖維素酶酶與底物比10.56U/g、中性蛋白酶酶與底物比2.64AU/kg、時(shí)間50min。在該工藝條件下浸提蘆筍葉，黃酮提取率為95.8%，提取液中氨基酸含量為20.1mg/g，黃酮提取率和提取液中氨基酸含量分別是空白試驗(yàn)對(duì)照組的121%和116%倍。同時(shí)表明酶復(fù)合作用時(shí)可節(jié)省酶量、縮短時(shí)間，從而提高蘆筍葉速溶茶浸提效率。

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Enzymatic Extraction Technology of Asparagus Instant Tea

CAI Guang-xia1，CHEN Ji-wang1,*，WANG Yuan-feng2，WEI Xin-lin2
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

TS272.4

A

1002-6630(2010)18-0018-04

2009-11-11

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z322)；上海崇明生態(tài)島建設(shè)重大科技專項(xiàng)(07DZ12043)；上海市科技啟明星項(xiàng)目(07QB14047)

蔡廣霞(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣呱罴庸C(jī)理及工程化。E-mail：caiguangxia@126.com

*通信作者：陳季旺(1971—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣呱罴庸C(jī)理及工程化。E-mail：jiwangchen@yahoo.com.cn