谷物中伏馬菌素B1酶聯(lián)免疫分析法的建立

劉師文，何慶華，鄒 龍，許 楊*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

谷物中伏馬菌素B1酶聯(lián)免疫分析法的建立

劉師文，何慶華，鄒 龍，許 楊*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

以匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)為載體，采用碳化亞二胺法人工合成伏馬菌素B1(FB1)抗原FB1-KLH，免疫大白兔獲得特異性良好的抗FB1多克隆抗體；在多克隆抗體的基礎(chǔ)上建立伏馬菌素B1的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，該方法IC50為11.7μg/L，最低檢出限1.1μg/L，平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為5.8%、10.2%；分析不同溶劑對標(biāo)準(zhǔn)曲線和加標(biāo)回收率的影響，確定PBS溶液為樣本最佳提取溶劑；在玉米、小麥、大米、高粱谷物樣本中添加50～500μg/kg的FB1標(biāo)準(zhǔn)品，平均回收率在70.5%～105.6%之間。將該方法應(yīng)用于40份谷物樣本中FB1的檢測，檢測結(jié)果與高效液相色譜的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9547。該方法簡單、靈敏、快速、準(zhǔn)確，適用于谷物中FB1的檢測。

伏馬菌素B1；酶聯(lián)免疫分析(ELISA)；谷物

伏馬菌素主要是由鐮刀菌Fusarium moniliforme和F.proliferatum產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)類似的真菌毒素，常見于玉米、高粱和大米等谷物及及其制品中[1]。其中FB1在自然污染的玉米中約占伏馬菌素總量的70%[2]，是造成污染的主要成分，也是導(dǎo)致伏馬菌素毒性作用的主要原因。它能引起馬腦脊髓白質(zhì)病、豬肺水腫、多種動物肝和腎細(xì)胞死亡以及再生性損害[3]，以及嚙齒類動物肝癌、腎癌[4]等。流行病學(xué)調(diào)查顯示人類食管癌與伏馬菌素污染有關(guān)[5]。國際癌癥研究中心將FB1歸為2B類致癌物質(zhì)[6]。

伏馬菌素分布廣泛且毒性較大，越來越受到人們的關(guān)注。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)公布的食用谷物中伏馬菌素的推薦最高限量為2mg/kg[7]；歐盟公布不同飼料中伏馬菌素的推薦最高限量標(biāo)準(zhǔn)為5mg/kg[8]。

加強(qiáng)FB1殘留的檢測是控制危害發(fā)生的重要手段。目前，糧食和飼料中FB1的檢測方法多采用高效液相色譜法[9-11]和免疫檢測法[12-13]。前者的靈敏度和特異性較高，樣品處理一般采用固相萃取或免疫親和層析，檢測時需對FB1進(jìn)行衍生化，樣品前處理過程復(fù)雜，成本較高。而在抗原抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上建立的免疫檢測法的樣品處理簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測速度快，能實(shí)現(xiàn)大量樣品的同時的檢測。本研究成功合成了FB1的

人工抗原，制備了抗FB1特異性兔多克隆抗體，在多克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了谷物中FB1靈敏快速的酶聯(lián)免疫分析法，對促進(jìn)FB1檢測技術(shù)的發(fā)展，控制FB1危害發(fā)生具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

伏馬菌素B1、伏馬菌素B2、黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、碳化亞二胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、嗎啡啉乙磺酸(MES)、弗氏完全佐劑和不完全佐劑 Sigma公司；雞卵清蛋白(OVA) 上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司；96孔可拆酶標(biāo)版 美國康寧公司；其他試劑純度均為分析純或更高純度。

酶標(biāo)儀 Thermo公司；超純水儀 Millipore公司；HPLC熒光檢測器 Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 抗FB1兔多克隆抗體的制備和鑒定

1.2.1.1 抗原合成

采用碳化亞二胺法合成人工抗原，參照文獻(xiàn)[14]并有所改進(jìn)，具體如下：

免疫抗原(FB1-KLH)：1mg FB1溶于0.5mL MES偶聯(lián)緩沖液(MES 21.3mg，NaCl 52.65mg， NaN32mg，蒸餾水定容至10mL)后與2.5mg KLH(溶于0.5mL超純水)混合，加入0.1mL 10mg/mL的新鮮配制的 EDC溶液。25℃攪拌反應(yīng)2h，靜置30min，4℃，PBS(0.01mol/L，pH7.4)透析，分裝于－20℃凍存。

檢測抗原(FB1-OVA)：1mg FB1溶于0.5mL MES偶聯(lián)緩沖液，稱取5mg OVA溶于1mL超純水，兩者混合，加入0.2mL 10mg/mL的新鮮配制的EDC溶液。25℃攪拌反應(yīng)2h，靜置30min，4℃，PBS透析，分裝于－20℃凍存。

1.2.1.2 多克隆抗體的制備

按500μg/只的劑量免疫兩只2kg左右的大白兔，首免時采用弗氏完全佐劑和等體積的免疫抗原混合后背部皮下多點(diǎn)注射(多于30個點(diǎn))，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)兔房。首免后間隔4周加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后第7天，耳緣靜脈采血，間接ELISA檢測血清的效價(jià)，三免后從實(shí)驗(yàn)兔腿動脈取全血。

抗血清采用辛酸-飽和硫酸法粗提，將粗提后獲得的抗體小劑量分裝至－20℃凍存。選取效價(jià)和靈敏度較高的兔抗體進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。

1.2.1.3 抗體的效價(jià)

A、將檢測抗原FB1-OVA用PBS稀釋至2.4μg/mL，100μL/孔包被96孔酶標(biāo)板，放入濕飯盒中4℃過夜；B、傾去包被液，PBST洗滌3次，拍干，每孔加入300 μL 5%的脫脂牛奶(溶于超純水)，37℃保濕封閉1h；C、傾去封閉液，PBST滿孔洗滌3次；D、加入經(jīng)PBS倍比稀釋的抗血清和陰性血清，同時設(shè)置陽性對照和空白對照(以PBS代替抗體)，每孔100μL，37℃保濕30min；E、PBST洗滌4次。每孔加100μL 1:1000的羊抗兔IgGHRP，37℃保濕30min；F、PBST洗滌3次，每孔加TMB底物液100μL，37℃保濕避光反應(yīng)5min；G、每孔50μL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的吸光度。以抗血清的吸光度至少兩倍于陰性血清的吸光度的最大稀釋倍數(shù)作為抗體效價(jià)(S＞2.1N)。1.2.1.4抗體特異性鑒定

A、酶標(biāo)板的包被和封閉與1.2.1.3節(jié)中的A～C相同；B、取包被封閉好的板條，加入經(jīng)PBS稀釋的50μL抗血清和50μL質(zhì)量濃度為125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9、0ng/mL溶于PBS的FB1競爭抗原[FB1、黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤酶烯酮(ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和FB2]混勻。37℃溫育30min；C.其余步驟與1.2.1.3節(jié)的E～G相同。

根據(jù)各加入的競爭抗原(FB1)的濃度制作競爭抑制曲線。

1.2.2 酶聯(lián)免疫分析法的建立

1.2.2.1 檢測抗原和多克隆抗體工作濃度的確定

將檢測抗原用PBS稀釋至0.6、1.2、2.4、4.8μg/mL、抗FB1多克隆抗體分別進(jìn)行2000至12.8萬倍倍比稀釋，進(jìn)行方陣滴定，確定ELISA檢測抗原包被濃度和抗體工作濃度。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用PBS將FB1檢測抗原稀釋至1.2μg/mL包被酶標(biāo)板。PBS將FB1標(biāo)品溶液稀釋至0.5～1000μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次，取OD450平均值計(jì)算結(jié)合率繪制抑制曲線。ELISA步驟參照文獻(xiàn)[15]。

包被7個批次的板條，每個4次重復(fù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算平均批間和批內(nèi)變異系數(shù)。

1.2.3 甲醇和乙腈體積分?jǐn)?shù)對ELISA影響

分別用含體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%、40%甲醇和乙腈的PBS進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的變化確定其對ELISA的影響。

1.2.4 不同提取液對加標(biāo)回收的影響

稱取粉碎的玉米樣品(經(jīng)HPLC檢測為FB1陰性)1g，加入FB1標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)量為500μg/kg，分別加5mL蒸餾水、PBS、75%甲醇-水(V/V)、50%乙腈-水(V/V)，

充分振蕩15min，4000×g離心10min，上清經(jīng)PBS稀釋10倍后進(jìn)行ELISA檢測。每種提取液重復(fù)提取3次，ELISA檢測時重復(fù)兩次(n=6)。

1.2.5 谷物樣本加標(biāo)回收率的測定

將FB1加到1g粉碎的谷物樣本(玉米、小麥、大米)，樣本均經(jīng)HPLC檢測為FB1陰性，每種樣品加標(biāo)3個質(zhì)量濃度，分別為50、200、500μg/kg，每個加標(biāo)質(zhì)量濃度重復(fù)3次，加入5mL提取溶液(由1.2.3節(jié)中的方法確定的溶液)充分振蕩15min，4000×g離心10min，取上清液進(jìn)行ELISA測定，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.640 份谷物樣本中FB1的檢測

采用建立的ELISA方法檢測40份谷物樣本，樣品提取方法參照1.2.4節(jié)方法，同時采用HPLC方法對照。

HPLC條件：流動相，甲醇-0.1mol/L NaH2PO4(85: 15，V/V)，加磷酸調(diào)pH3.35，流速0.9mL/min，熒光檢測，激發(fā)波長335nm，放射波長440nm。樣品經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱預(yù)處理后，臨苯二甲醛(OPA)衍生1min，取20μL進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗FB1多克隆抗體的制備和鑒定

2.1.1 抗體的效價(jià)

圖1 抗體效價(jià)測試Fig.1 Determination of antibody titer

每次加強(qiáng)免疫后的第7天對兔進(jìn)行耳緣靜脈采血，采用間接非競爭ELISA監(jiān)測兔抗血清效價(jià)變化，兩只實(shí)驗(yàn)兔的效價(jià)相當(dāng)。圖1例舉了其中一只兔抗體效價(jià)測試結(jié)果。由圖可見，抗體效價(jià)達(dá)128000。

2.1.2 抗體的特異性

采用間接競爭ELISA分析兔多克隆抗體與AFB1、OTA、DON、ZEN與FB1、FB2交叉反應(yīng)，抑制曲線見圖2。由圖可見，抗體能識別FB1與FB2，不能識別AFB1、OTA、DON、ZEN與FB1、FB2的交叉反應(yīng)率(CR)分別為100%、75%[CR=100×IC50(FB1)÷IC50(參試毒素)]，與其他4種真菌毒素未見交叉反應(yīng)。

圖2 抗體與常見真菌毒素的交叉反應(yīng)Fig.2 Cross-reactivity between antibodies and common mycotoxins

2.2 酶聯(lián)免疫分析方法的確立

2.2.1 檢測抗原濃度和抗體工作濃度

采用間接非競爭ELISA，方正滴定確定最佳抗原包被、抗體工作濃度，方陣滴定結(jié)果見表1，確定檢測抗原包被質(zhì)量濃度為1.2μg/mL，抗體工作濃度為1: 8000。

表1 抗原質(zhì)量濃度和抗體稀釋度方正滴定Table 1 Detection of indirect ELISA

2.2.2 間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用1.2μg/mL 檢測抗原包被濃度和1:8000兔多抗工作濃度建立FB1間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=－16.705lnX+91.059(R2= 0.9921)，IC50為11.7μg/L，最低檢出限1.1μg/L(IC10)。

圖3 FB1間接競爭ELISA抑制曲線Fig.3 Indirect ELISA inhibition curve of FB1

7個批次的板條繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線平均批間變異系數(shù)為10.2%，平均批內(nèi)變異系數(shù)為 5.7%，該方法的重復(fù)性良好。

2.3 甲醇、乙腈體積分?jǐn)?shù)對ELISA抑制曲線的影響

研究5%～40%的甲醇和乙腈對ELISA的影響，結(jié)果見圖4。由圖可知，不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇和乙腈對ELISA抑制曲線都有影響，隨著兩種有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的升高，IC50值增大，曲線的線性也發(fā)生改變。10%以內(nèi)的甲醇、乙腈對ELISA的影響相對較小。因此做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)時，樣品粗提液應(yīng)該用PBS將有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)稀釋至10%以內(nèi)進(jìn)行ELISA檢測。

圖4 有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)對ELISA抑制曲線的影響Fig.4 Effect of organic solvent volume on indirect ELISA inhibition curve linearity of FB1

2.4 不同提取液對加標(biāo)回收的影響

在經(jīng)HPLC檢測的FB1陰性玉米樣品中加入FB1標(biāo)準(zhǔn)品，最終加入量為500μg/kg，分別采用PBS、蒸餾水、75%甲醇-水、50%乙腈-水作提取液，粗提液經(jīng)PBS稀釋10倍后ELISA檢測，結(jié)果見表2。由表可見，4種提取液對加標(biāo)回收率的影響有很大的區(qū)別，其中75%的甲醇-水回收率較低，為51.1%；用50%乙腈-水提取的回收率為141.7%，易造成假陽性。采用PBS溶液提取的回收率為95.5%，因而選取PBS做為最佳提取液。

表2 不同提取液加標(biāo)回收結(jié)果(n=6)Table 2 Effect of extraction solvent type on spike recovery rate of FB1 (n=6)

2.5 谷物樣本中加標(biāo)回收率

采用PBS做提取溶液，對玉米、小麥、大米、高粱樣本做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表可見，在玉米、小麥、大米、高粱樣本中，加標(biāo)50、200、500μg/kg的FB1標(biāo)準(zhǔn)品，平均加標(biāo)回收率分別為89.7%、70.5%、98.6%、105.6%。

表3 谷物樣本中加標(biāo)回收結(jié)果(n=6)Table 3 Recovery rates of FB1in cereal samples spiked at different levels (n=6)

2.6 谷物樣本中FB1含量的ELISA檢測結(jié)果

表4 40份谷物樣品中FB1的ELISA和HPLC檢測結(jié)果Table 4 FB1concentrations in 40 cereal samples determined by this method and HPLC

采用建立的ELISA方法篩查了40份谷物樣本，同

時使用HPLC方法檢測。ELISA結(jié)果顯示，在40份樣本中有28份樣本被FB1污染，檢出率為70%，在陽性樣本中FB1含量為35.1～6774.8μg/kg。HPLC結(jié)果顯示，在40份樣本中有26份樣本被FB1污染，檢出率為65%，在陽性樣本中FB1含量為24.9～3266.5μg/kg。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩種方法的結(jié)果相關(guān)性良好，YELISA=1.6226XHPLC+ 2.547(R2=0.9547)。

3 討 論

抗原合成中載體，合成的方法，佐劑的種類以及免疫的劑量，以及免疫的方式的都是影響抗體FB1抗體特異性以及親和力的因素[12,14,16]。在這些報(bào)道的文獻(xiàn)中FB1與載體KLH偶聯(lián)獲得的抗體特異性最好，效價(jià)最高[17]，因此本研究采用KLH作為載體制備免疫抗原。兩只實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)過抗原免疫后都獲得了抗FB1的抗體，抗體的效價(jià)達(dá)128000。

FB1易溶于水、甲醇、乙腈等溶劑，有文獻(xiàn)報(bào)道了采用50%乙腈-水(V/V)[18]75%甲醇-水(V/V)[13]做提取溶劑，本研究發(fā)現(xiàn)不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇和乙腈對ELISA抑制曲線都有影響，75%的甲醇-水回收率不理想，而50%乙腈-水采用這種溶劑可能造成假陽性，本實(shí)驗(yàn)中采用PBS溶液做提取液回收率較理想，而且安全環(huán)保。

4 結(jié) 論

采用碳化亞二胺法，以KLH為載體制備了FB1人工抗原免疫大白兔后獲得了特異性抗體，抗體效價(jià)達(dá)128000，在多克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了間接競爭ELISA方法，該方法IC50為11.7μg/L，最低檢出限1.1μg/L，批內(nèi)變異系數(shù)5.8%，批間變異系數(shù)10.2%。將建立的方法運(yùn)用于40份谷物樣本中FB1含量的檢測，檢測結(jié)果與HPLC方法結(jié)果的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9547。該方法靈敏快速、操作方便、準(zhǔn)確，適用于谷物中FB1的檢測。

[1]VOSSA K A, SMITH G W, HASCHEK W M. Fumonisins: Toxicokinetics, mechanism of action and toxicity[J]. Animal Feed Science and Technology, 2007, 137: 299-325.

[2]ROSS P F, RICE L G, OSWEILER G D, et al. A review and update of animal toxicoses associated with fumonisin contaminated feeds and production of fumonisins by Fusarium isolates[J]. Mycopthol, 1992, 117: 109-114.

[3]RICHARD J L. Some major mycotoxins and their mycotoxincoses: an overview[J]. Inthernational Journal of Food Microbiology, 2007, 119: 3-10.

[4]Geneva World Health Organization. Envrionmental Health Critera 219, FumonisinB1[S]. 2000.

[5]邱茂鋒, 劉秀梅, 王玉華, 等. 某食管癌高發(fā)區(qū)人群伏馬菌素?cái)z入量及尿二氫神經(jīng)鞘氨醇-神經(jīng)鞘氨醇比值的調(diào)查[J]. 衛(wèi)生研究, 2001, 30: 365-367.

[6]International agency for research on cancer. IARC Monographs on the evaluation of carcinogen risk to human[M]. Lyon: World Health Oranisation, 2002.

[7]U.S. Food and Drug Administration Center for Food Safety and Applied Nutrition Center for Veterinary Medicine. Fumonisin levels in human foods and animal feed[S]. 2001.

[8]The commission of the European communttes. On the presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T-2 and HT-2 and fumonisins in products intended for animal feeding[J]. Official Journal of the European Union, 2006: 7-8.

[9]TSENG T C, LIU C Y. Occurrence of fumonisin B1in maze inmported into Taiwan[J]. Inteternational Journal of Food Microbiology, 2001, 65: 23-26.

[10]鄭鐵松, 鐘文輝. 高效液相色譜法測定食品中的伏馬菌素[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(3): 135-138.

[11]ARCOB G D, FERNANDEZ-FRANZONA M, FONT G A, et al. Analysis of fumonisins B1, B2and B3in corn-based baby food by pressurized liquid extraction and liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 12(9): 188-194. [12]BARNA-VETRO I, SZABO E, FAZEKAS B. Development of a sensitive ELISA for the determination of fumonisin B1in Cereals[J]. J Agric Food Chem, 2000, 48: 2821-2825.

[13]QUAN Ying, ZHANG Yan, WANG Shuo, et al. A rapid and sensitive chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of fumonisin B1in food samples[J]. Analytica Chimica Acta, 2006, 580: 1-8.

[14]YU F Y, CHU F S. Production and characterization of antibodies against FB1[J]. Journal of Food Protection, 1996, 59: 992-997.

[15]鄧舜洲, 游淑珠, 許楊. 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇酶聯(lián)免疫檢測方法的建立[J]. 食品科技, 2006(8): 222-224.

[16]AZCONA-OLIVER J I, ABOUZIED M M, PESTKA J J, et al. Generation of antibodies reactive with fumonisins B1, B2, B3by using cholera toxin as the carrier-adjuvant[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1992, 58: 169-173.

[17]YEUNG J M, PRELUSKY D B, SAVARD M E, et al. Sensitive immunoassay for fumonisinB1in corn[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44: 3582-3586.

[18]HOLCOMB M, THOMPSON H C, HUNKINS L J. Analysis of fumonisin B1in rodent feed by gradient elution HPLC using precolumn derivatization with FMOC and fluorescence detection[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1993, 41: 761-767.

Development of an ELISA Method for Determining Fumonisin B1in Cereals

LIU Shi-wen，HE Qing-hua，ZOU Long，XU Yang*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-Germany Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Polyclonal antibodies against fumonisin B1were produced in rabbits with FB1/keyhole limpet hemocyanin conjugate. A sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determining FB1was developed. The concentration of FB1causing 50% inhibition of binding enzyme marker (IC50) was 11.7μg/L and the detection limit was 1.1μg/L. The average variation coefficients in intragroup and intergroup were 5.8% and 10.2%, respectively. PBS was selected as the best extract solvent through extensive investigations. The recovery rates from corn, wheat, rice and sorghum samples spiked at a level varying from 50 to 500μg/kg ranged from 70.5% to105.6%. The contents of FB1in 40 cereal samples were screened by the developed ELISA method and the results exhibited a positive correlation with the results from HPLC (R2= 0.9547). This method is sensitive, fast and accurate and therefore is suitable for screening the presence of FB1 in cereals.

fumonisin B1；ELISA；cereal

TS207.3

A

1002-6630(2010)18-0350-05

2010-05-05

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z427)

劉師文(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿用庖邔W(xué)。E-mail：luishiwen985@126.com

*通信作者：許楊(1951—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：xuyang1951@163.com