纖維素酶酶解醇葛根素研究

王星敏，殷鐘意，李 鑫，張渝文

(1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，重慶 400067；2.重慶大學(xué)資源及環(huán)境科學(xué)學(xué)院，重慶 400033；3.重慶工商大學(xué) 廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程中心，重慶 400067)

纖維素酶酶解醇葛根素研究

王星敏1,2,3，殷鐘意1,3，李 鑫1，張渝文1

(1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，重慶 400067；2.重慶大學(xué)資源及環(huán)境科學(xué)學(xué)院，重慶 400033；3.重慶工商大學(xué) 廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程中心，重慶 400067)

以提取葛粉后的葛根廢渣為研究對(duì)象，采用微生物和代謝物酶解提制葛根素，通過高效液相色譜法分析葛根素含量，考察影響葛根素溶出的酶解時(shí)間、酶量、pH值、固液比等參數(shù)，探索微生物與底物葛渣間的生物交互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：葛根廢渣5g，纖維素酶量為底物40%，葛根廢渣與水的質(zhì)量比為1:10，pH值為5，在30℃酶解36h后，經(jīng)乙醇浸提3h，可提取葛根素33.54mg，為葛根廢渣的資源化再利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

纖維素酶；葛根素；葛根廢渣；酶解；交互作用

生物交互作用[1]指一因子因另一因子的不同水準(zhǔn)具有不同的效果。鮮葛根主要以有異黃酮類化合物(約1.3%)、淀粉(約40.0%)和膳食纖維(40.0%)為主，作為醫(yī)藥和保健食品的原料或添加劑[2]的葛根素多附著在纖維等植物組織壁上。隨著葛根素在醫(yī)藥和保健行業(yè)[3]的深入開發(fā)和廣泛食用，異黃酮類化合物的提取越來越其引起科研者和開發(fā)商的關(guān)注；而纖維素酶具有降解植物纖維原料的作用，常被應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取[4]或功能食品的開發(fā)[5]，逐漸有代替提取葛根素的四大傳統(tǒng)工藝[6]之勢(shì)。但在微生物酶解提制葛根素的體系中，微生物及依存空間均以開放形式存在于化學(xué)因子和物理因子的環(huán)境因素中，微生物菌種不可避免地與各因素發(fā)生交互作用；影響纖維素酶產(chǎn)量和活力的因素除菌種外，還有pH值、培養(yǎng)溫度、水分、基質(zhì)等；這些因素不是孤立存在的，而是相互聯(lián)系的。為實(shí)現(xiàn)葛渣資源綜合利用，本實(shí)驗(yàn)以提取葛粉后的葛根廢渣為研究對(duì)象，采用生物酶解法降解葛渣植物組織，減少葛根素提取傳質(zhì)阻力[4]，通過測(cè)定葛根素含量，探索酶與植物組織間生物交互作用的影響因素，為葛產(chǎn)業(yè)集約化發(fā)展而囤積的葛根廢渣消減及資源綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根廢渣(提取葛根淀粉)取自重慶北碚農(nóng)戶。

葛根素(標(biāo)品)、乙醇(分析純)、硫酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)和甲醇(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

GOLD 166P高效液相色譜儀 美國System公司；DELTA 320-5 pH計(jì) 梅普勒-托利多儀器廠；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-B往返水浴恒溫振蕩器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)方法

選用白腐真菌等微生物，分別經(jīng)過斜面培養(yǎng)、種子液體培養(yǎng)后，按一定比例接種入搖瓶培養(yǎng)；接入量為5%，29℃、180r/min條件下，混合培養(yǎng)48h。

1.3.2 酶解提制方法

稱取粉碎后20目的葛根廢渣5.00g至0.25L干凈的錐形瓶中，設(shè)定固液比、溫度、pH值，按比例接入培養(yǎng)好的菌種接種液或纖維素酶，發(fā)酵處理一定時(shí)間后，過濾，測(cè)定酶解液中的葛根素含量；根據(jù)葛根素溶于水中微溶的性質(zhì)，用乙醇浸提濾渣，測(cè)定醇提液中的葛根素含量，二者之和為葛渣中葛根素的含量；合并測(cè)定液，經(jīng)大孔樹脂富集、純化，蒸餾后得產(chǎn)品。

1.3.3 提取工藝參數(shù)

葛根廢渣與水質(zhì)量比為1:10，微生物(纖維素)接種量5%～40%，酶解溫度20～40℃，pH4～8，在水浴恒溫振蕩器中連續(xù)酶解36h，進(jìn)間歇通過無菌空氣(平均10min/h)；乙醇與葛渣固液比為1:15，醇提時(shí)間3h。1.3.4分析方法

采用色譜分析方法[8-9]測(cè)定葛根素標(biāo)品。繪制葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到葛根素質(zhì)量濃度(x，g/L)與峰面積(y)的關(guān)系方程：y=35415x-14502，R2=0.9993；色譜條件為：色譜柱：C18；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇-水(25:75)；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積：10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶酶解活力比較

2.1.1 酶解法與常規(guī)化學(xué)醇提法的比較

圖1 生物酶解法與常規(guī)醇提法的比較Fig.1 Comparison of extraction method with biological enzymes and conventional ethanol extraction

纖維素酶是一種復(fù)合酶，主要包含外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等[10]，還有很高活力的木聚糖酶活力，易催化水解破壞葛根細(xì)胞壁的纖維結(jié)構(gòu)。對(duì)比酶解生物效應(yīng)和化學(xué)醇提效應(yīng)，選用相同量乙醇分別浸提相同質(zhì)量的葛根廢渣。由圖1可知，在任一時(shí)間，經(jīng)酶解后的葛根素溶出量均高于常規(guī)化學(xué)醇提法，且經(jīng)4h后常規(guī)醇提法提取葛根素變化趨于平緩約11.05mg；而酶解法在36h有最大值為24.71mg，明顯高于常規(guī)化學(xué)醇提法。

2.1.2 微生物與纖維素酶酶解作用對(duì)比

纖維素酶只是微生物代謝酶的一種，為比較微生物和代謝物酶之間的酶解優(yōu)勢(shì)，在相同條件下，選擇管囊酵母、白腐真菌和纖維素酶處理相同質(zhì)量的原料，由圖2可知，纖維素酶解出葛根素含量高于管囊酵母和白腐真菌，表現(xiàn)較強(qiáng)的酶解性能，且在36h時(shí)，獲得葛根素量為23.42mg。原因在于：在酶解初期，微生物能代謝出不同酶，催化降解植物組織能力較強(qiáng)，釋放葛根素量較強(qiáng)，但隨著時(shí)間的進(jìn)行，微生物菌種易退化而降低產(chǎn)酶力[11]，降低降解植物組織能力，葛根素的有效釋放能力明顯低于纖維素酶。

圖2 微生物與纖維素酶的酶解作用對(duì)比Fig.2 Comparison on enzymatic hydrolysis effect of cellulose and microorganisms

2.2 不同纖維素酶量對(duì)葛根素含量的影響

設(shè)定加酶量(纖維素酶投入量與底物質(zhì)量)比為5%、10%、20%、30%、40%。由圖3可知，投入量為40%時(shí)，葛根素的含量最高，質(zhì)量濃度為0.485mg/mL，含量為24.24mg。原因在于：纖維素酶在分解纖維素時(shí)起生物催化作用[12-13]，投入量適中有助于催化葛根植物組織降解，葛根素得以充分釋放。

圖3 不同加酶量對(duì)葛根素含量的影響Fig.3 Effect of cellulose content on extraction rate of puerarin

2.3 酶解環(huán)境因素對(duì)葛根素浸出的影響

2.3.1 不同固液比對(duì)葛根素含量的影響

對(duì)比圖4酶提液和醇提液中葛根素含量可知，纖維素酶解活力受酶解體系固液比的影響，相同量的葛根廢渣釋放出不同量的葛根素；當(dāng)酶解固液比為1:10，葛根素酶解量明顯高于醇提量，溶出量高達(dá)17.837mg，葛根素總量為28.590mg。這是由于當(dāng)培養(yǎng)基含水量過低，物料疏松，纖維素酶無法完全吸附底物，酶活力不夠，降解能力變低；培養(yǎng)基含水量過大，物料過于黏稠，供氧及散熱條件惡化，酶催化效率降低，導(dǎo)致葛根素得率也隨之降低。

圖4 固液比對(duì)葛根素含量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of puerarin

2.3.2 不同pH值對(duì)葛根素含量的影響

圖5 不同pH值對(duì)葛根素含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH value on extraction rate of puerarin

大多數(shù)酶作用于底物有最適pH值[14]，一般為4.0～6.0。從圖5可以看出，纖維素酶在酸性條件影響較小，且在pH5時(shí)，纖維素酶表現(xiàn)出最適應(yīng)，其葛根素質(zhì)量濃度分別為0.397mg/mL和0.347mg/mL；但在pH8時(shí)，纖維素酶的催化水解能力明顯下降，葛根素得率最低。

2.3.3 不同酶解溫度對(duì)葛根素含量的影響

酶類屬于蛋白質(zhì)類物質(zhì)[15]，大多數(shù)纖維素酶都具有較高穩(wěn)定性；但對(duì)溫度較敏感，而適宜溫度一般可增大酶活性，促進(jìn)植物纖維的降解。由圖6可以看出，發(fā)酵溫度的變化對(duì)酶解獲取葛根素影響較大，當(dāng)溫度為30℃時(shí)，酶解活力充分，葛根素提取量達(dá)到最高為14.719mg。

圖6 不同酶解溫度對(duì)葛根素含量的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of puerarin

2.4 葛根素液相成分分析

圖7 葛根素樣品與標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖對(duì)比Fig.7 Comparison on liquid chromatographs of samples and standard product

通過以上纖維素酶作用及單因素試驗(yàn)，確立了酶解提制葛根素的交互作用效應(yīng)的影響因素及最佳條件。將5g葛根廢渣在各個(gè)最佳條件下酶解36h后，經(jīng)一定量乙醇浸提3h，能提取葛根素33.54mg，高于單因素試驗(yàn)值，是常規(guī)化學(xué)醇提法(11.05mg)的3倍。由圖7可知，樣品中酶解所得產(chǎn)物均為葛根素。

3 結(jié) 論

3.1 生物酶解法優(yōu)于常規(guī)化學(xué)醇提法，且纖維素酶的酶解效果優(yōu)于微生物。

3.2 影響生物酶解提制葛根素的交互作用效應(yīng)的因素為：投入底物質(zhì)量的40%的纖維素酶，設(shè)置固液比為1:10，pH5，在30℃酶解36h，經(jīng)一定量的乙醇醇提3h，5g葛根廢渣能獲得葛根素33.54mg，是常規(guī)化學(xué)醇提法的3倍。

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Ethanol Extraction of Puerarin by Cellulase Hydrolysis

WANG Xing-min1,2,3，YIN Zhong-yi1,3，LI Xin1，ZHANG Yu-wen1
(1. School of Environmental and Biological Engineering, Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China；2. School of Resources and Environmental Science; Chongqing University, Chongqing 400033, China；3. Engineering Research Centre for Waste Oil Recovery Technology and Equipment, Ministry of Education, Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China)

Puerarin was extracted by enzymatic hydrolysis with microbe and cellulase from waste pueraria. High performance liquid chromatography was used to determine puerarin content for exploring the effects of enzymatic hydrolysis time, enzyme addition amount, pH and material-liquid ratio as well as cross-interaction on extraction rate of puerarin. Results indicated that pueraria amount of 5 g, cellulose concentration of 40% compared with pueraria weight, pueraria-water ratio of 1:10, enzymatic hydrolysis pH of 5, enzymatic hydrolysis temperature of 30 ℃, enzymatic hydrolysis time of 36 h and ethanol extraction time of 3 h. Under the optimal enzymatic hydrolysis and extraction conditions, the yield of puerarin was up to 33.54 mg. These investigations will provide a theoretical reference for the exploration and utilization of pueraria.

cellulase；puerarin；pueraria waste；enzymolysis；biological interaction

TQ 028.8

A

1002-6630(2010)24-0046-04

2010-09-21

重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目(cstc，2010AC1061)；重慶市教委科技項(xiàng)目(cqjwKJ100708)

王星敏(1975—)，女，副教授，博士研究生，主要從事固體廢棄物資源化開發(fā)與資源化利用研究。E-mail：wxm0826@ctbu.edu.cn