木聚糖酶Shearzyme 500L酶解蔗渣木聚糖的特性研究

石國(guó)良，周玉恒，張厚瑞,*，蔡愛(ài)華，陳海珊

(1.廣西植物研究所，廣西 桂林 541006；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

木聚糖酶Shearzyme 500L酶解蔗渣木聚糖的特性研究

石國(guó)良1,2，周玉恒1，張厚瑞1,*，蔡愛(ài)華1，陳海珊1

(1.廣西植物研究所，廣西 桂林 541006；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

以木聚糖酶Shearzyme 500L水解蔗渣木聚糖制備低聚木糖，用DNS法測(cè)定酶解液中的總糖和還原糖，HPLC法測(cè)定酶解產(chǎn)物組成，其適宜的水解條件為底物質(zhì)量濃度3g/100mL、pH5.0、60℃、木聚糖中酶用量50U/g、水解時(shí)間24h。在此條件下底物水解率約為63.1%，水解產(chǎn)物的81.5%為低聚木糖，其中木二糖占54.8%，木三糖占26.7%。Shearzyme 500L不能將一分子木二糖水解為兩個(gè)木糖單糖，但能水解木三糖并相應(yīng)生成木二糖與木糖。副產(chǎn)物木糖能顯著抑制Shearzyme 500L活性，降低木聚糖的水解率。

木聚糖酶；蔗渣木聚糖；低聚木糖

低聚木糖主要指2～4個(gè)木糖以β-1,4-糖苷鍵連接的聚合物。低聚木糖不僅在動(dòng)物體內(nèi)有極為突出的雙歧桿菌增殖效果，并具有用量少，耐酸、耐熱性強(qiáng)等特點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥工業(yè)中的特殊應(yīng)用價(jià)值為其他低聚糖所不能替代。

低聚木糖主要用酶法水解木聚糖生產(chǎn)。木聚糖水解酶系主要包括內(nèi)切木聚糖酶與β-木糖苷酶。內(nèi)切木聚糖酶以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈內(nèi)部的β-1,4-糖苷鍵，作用前期是聚合度較大的低聚木糖，隨著水解的深入最后生成以木三糖、木二糖為主要成分的低聚糖。β-木糖苷酶主要水解短鏈的低聚木糖，并從非還原性末端釋放出木糖單糖，木二糖是此酶的最好底物。

低聚木糖的工業(yè)化生產(chǎn)所選用的酶制劑除了要有足夠的食品衛(wèi)生安全性之外，它的內(nèi)切木聚糖酶活力應(yīng)盡可能高而β-木糖苷酶活力盡可能低，以保證水解產(chǎn)物有較高的木二糖、木三糖含量，有效提高產(chǎn)物品質(zhì)。

盡管國(guó)內(nèi)關(guān)于低聚木糖生產(chǎn)用酶的研究報(bào)道已經(jīng)很多[1-7]，但均限于產(chǎn)木聚糖酶微生物篩選，以及產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)、酶的分離純化、酶學(xué)特性等方面，迄今尚未見(jiàn)商業(yè)性木聚糖酶制劑用于制備低聚木糖的報(bào)道。顯然，尋找符合這種要求的木聚糖酶制劑來(lái)源，對(duì)于推動(dòng)低聚木糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

諾維信OR真菌木聚糖酶Shearzyme 500L是一種食品級(jí)酶制劑，主要作用于禾本植物木聚糖，對(duì)淀粉及蛋白質(zhì)沒(méi)有作用。Shearzyme 500L在小麥淀粉濕法生產(chǎn)過(guò)程中，用于提高淀粉與谷朊粉的分離效果、縮短分離時(shí)間、降低水及能源的消耗[8]；在啤酒釀制中用于改善麥芽汁的澄清過(guò)濾性能[9]。本實(shí)驗(yàn)研究Shearzyme 500L用于水解蔗渣木聚糖制備低聚木糖的一些酶學(xué)特性(最適溫度、pH值、酶用量、酶解時(shí)間、底物質(zhì)量濃度等)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

酶制劑：真菌木聚糖酶500L(Shearzyme 500L) 諾維信生物技術(shù)有限公司。

D-木糖、L-阿拉伯糖、木糖醇(樣品純度＞99%)本實(shí)驗(yàn)室制備；蔗渣木聚糖按文獻(xiàn)[10]方法制備，純度約80%；木二糖、木三糖標(biāo)準(zhǔn)品 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HY-M1001強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、HY-M 2007強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂 北京海德能科技有限公司； Waters 510高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市正基儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；XM60水分分析儀、XS225A-SCS分析天平 瑞士普利賽斯公司。

1.2 方法

1.2.1 溫度對(duì)Shearzyme 500L木聚糖酶活性的影響

酶反應(yīng)的最適溫度：在不同溫度(30～95℃)條件下，按酶活測(cè)定方法測(cè)定酶的活性。以最高活性為100%，計(jì)算各溫度下酶的相對(duì)活力。

酶的溫度穩(wěn)定性：將適量酶液與0.05mol/L、pH5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在不同的溫度(30～95℃)保溫2h，立即在0℃冰箱中冷卻，測(cè)定酶的活性，以室溫(25℃)未經(jīng)保溫處理時(shí)測(cè)定的酶活性為100%。

1.2.2pH值對(duì)Shearzyme 500L木聚糖酶活性的影響

酶反應(yīng)的最適pH值：在不同pH值范圍(3～8)的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制的木聚糖溶液中測(cè)定酶的活性。以最高活性為100%，計(jì)算各pH值下酶的相對(duì)活力。

酶的pH值穩(wěn)定性：將適量酶液與不同pH值的緩沖液在室溫(25℃)放置2h，測(cè)定酶的活性，以未用緩沖液處理的酶活性為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.3 酶用量對(duì)水解液中還原糖和總糖的影響

底物質(zhì)量濃度2g/100mL的木聚糖溶液，按10～ 250U/g底物加入酶液，于60℃條件下反應(yīng)24h，測(cè)定水解液中還原糖和總糖含量。

1.2.4 酶解時(shí)間對(duì)水解液中還原糖、總糖以及產(chǎn)物成分的影響

底物質(zhì)量濃度2g/100mL的木聚糖溶液，在底物中按50U/g加入酶液，于60℃條件下反應(yīng)，間隔一定時(shí)間取樣測(cè)定還原糖、總糖含量和酶解產(chǎn)物。

1.2.5 底物質(zhì)量濃度對(duì)水解液中還原糖和總糖的影響

底物質(zhì)量濃度2～10g/100mL的木聚糖溶液，在底物中按50U/g加入酶液，于60℃條件下反應(yīng)24h，測(cè)定還原糖和總糖含量。

1.2.6 酶活和還原糖含量測(cè)定

酶活測(cè)定使用DNS法[11]：1.8mL 2g/100mL蔗渣木聚糖懸浮液(pH5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)，加入0.2mL適當(dāng)稀釋的酶液(空白對(duì)照加入滅活的酶液)，70℃精確反應(yīng)5min，取0.2mL反應(yīng)液，加入0.5mL DNS試劑，沸水顯色5min，迅速冷卻后定容至5mL，于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定520波長(zhǎng)處吸光度。以木糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度A520nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活力定義為每分鐘分解蔗渣木聚糖產(chǎn)生1μmol木糖所需的木聚糖酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

還原糖含量測(cè)定：0.2mL適當(dāng)稀釋的糖液(空白對(duì)照為純水)，加入0.5mL DNS試劑，沸水顯色5min，迅速冷卻后定容至5mL，于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定520nm波長(zhǎng)處吸光度。木糖含量與A520nm存在以下對(duì)應(yīng)關(guān)系：

木糖含量/(mg/mL)=0.7646×A520nm＋0.1186

1.2.7 總糖含量測(cè)定

15mL低聚木糖溶液，加入5mL 0.8mol/L H2SO4配成終濃度0.2mol/L H2SO4溶液，100℃水解2h，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值到7.0，稀釋一定倍數(shù)后，按1.2.6節(jié)方法測(cè)定總還原糖含量。

木聚糖總糖含量=總還原糖含量×0.9

1.2.8 酶解產(chǎn)物成分分析

高效液相色譜法：用適量水將酶解溶液稀釋至總糖含量約10g/L，取10mL稀釋液加3g HY-M2007強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，1g HY-M1001強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂脫鹽凈化，凈化液經(jīng)0.22μm水性微孔濾膜過(guò)濾得檢測(cè)樣品。Waters 510高效液相色譜儀，410示差折光檢測(cè)器。色譜柱，BC-100碳水化合物Ca2+柱。流動(dòng)相：超純水1mL/min，柱溫80℃。分別取標(biāo)準(zhǔn)樣品于60℃烘干至質(zhì)量恒定，用超純水配制成質(zhì)量濃度10.0g/L。

紙層析展開(kāi)劑：正丁醇:吡啶:水= 4:3:3(V/V)；顯色劑：水飽和的正丁醇配制，含2g/100mL二苯胺、體積分?jǐn)?shù)2%鄰苯二甲酸溶液，噴霧后加熱顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解產(chǎn)物的組成

HPLC結(jié)果(圖1)顯示蔗渣木聚糖經(jīng)Shearzyme 500L充分水解后，產(chǎn)物主要為木二糖和木三糖，還有少量的木糖。其中木二糖約占總糖的54.77%、木三糖占26.7%、木糖約7%。紙層析結(jié)果(圖2)也驗(yàn)證了產(chǎn)物主要為木二糖和木三糖以及木糖。

圖1 酶解產(chǎn)物的HPLC流出曲線Fig.1 HPLC elution profile of hydrolysates of bagasse xylan

圖2 酶解產(chǎn)物紙層析結(jié)果Fig.2 Paper chromatography analysis result of hydrolysates of bagasse xylan

目前研究的大多數(shù)木聚糖酶水解產(chǎn)物中木二糖所占比例均較低(30%左右)[12]，楊瑞金等[13]采用蒸煮法提取玉米芯木聚糖后加酶水解生產(chǎn)低聚木糖得到了54.1%木二糖和19.8%木三糖，其中還含有7.7%阿拉伯糖和6.8%葡萄糖以及11.5%木糖；黃家驥[14]用Bacillus pumilus WUN024產(chǎn)木聚糖酶水解玉米芯木聚糖，精制后只獲得了65.52%的木二糖和木三糖低聚木糖溶液；張東華[15]用木霉TF(擬康氏木霉Trichoderma pseudokongii TF)在實(shí)驗(yàn)室水平的水解產(chǎn)物中低聚木糖含量為89.877%，但是其中除了木二糖和木三糖之外還有木四糖到木六糖的寡糖成分。相比之下，Shearzyme 500L水解蔗渣木聚糖產(chǎn)物中主要成分木二糖和木三糖占總糖比例高達(dá)81.5%，這說(shuō)明用Shearzyme 500L水解木聚糖，可以獲得高含量低聚木糖的水解產(chǎn)物。

2.2 溫度對(duì)Shearzyme 500L木聚糖酶活性的影響

Shearzyme 500L的酶活性隨溫度而升高，并在85℃時(shí)達(dá)到最大值，此后溫度繼續(xù)升高則酶活性急劇下降；酶活性在60℃以下表現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定，溫度變化對(duì)殘余酶活性的影響不大，高于60℃之后的酶穩(wěn)定性明顯下降，殘余酶活性隨溫度升高而快速下降(圖3)。

圖3 溫度對(duì)木聚糖酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the activity and stability of xylanase

在濕法生產(chǎn)小麥淀粉的過(guò)程中，使用Shearzyme 500L的目的是加速淀粉粒的沉淀，改善谷朊分離澄清效果。啤酒釀制使用Shearzyme 500L，主要目的是改善過(guò)濾性能。它們都沒(méi)有將木聚糖徹底水解為木二糖與木三糖的要求，所以總體處理時(shí)間都比較短。對(duì)于低聚木糖生產(chǎn)而言，為避免水解物停留在聚合度較高的階段通常需要水解比較長(zhǎng)時(shí)間，以獲得木二糖和木三糖含量較高的水解產(chǎn)物。顯然，低聚木糖生產(chǎn)所用的水解溫度不宜太低，否則長(zhǎng)時(shí)間的水解過(guò)程易造成微生物污染。由圖3看出，Shearzyme 500L用于低聚木糖生產(chǎn)的適宜溫度可設(shè)定在60℃左右，因?yàn)檫@一溫度條件不僅可以滿足防污染的要求，而且Shearzyme 500L仍表現(xiàn)有較高的木聚糖酶活性，經(jīng)較長(zhǎng)保溫時(shí)間之后的酶活性仍不會(huì)顯著降低。

2.3 pH值對(duì)Shearzyme 500L活性的影響

圖4 pH值對(duì)木聚糖酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of hydrolysis pH on the activity and stability of xylanase

pH值變化對(duì)Shearzyme 500L酶活性影響明顯，對(duì)酶穩(wěn)定性的影響則相對(duì)微弱(圖4)?？偟内厔?shì)是，Shearzyme 500L的最適pH值在5.0左右，在此條件下穩(wěn)定性也最好。因此，Shearzyme 500L用于低聚木糖生產(chǎn)時(shí)，所選擇的pH值在5.0為宜，它與用于小麥淀粉生產(chǎn)所用的最適pH值一致。

Shearzyme 500L用于低聚木糖與用于小麥淀粉制造的最適pH值一致，這種現(xiàn)象可從兩方面理解，其一，Shearzyme 500L在pH5條件下的酶蛋白構(gòu)象或解離狀態(tài)具有較高的催化活力；其二，小麥木聚糖與蔗渣木聚糖一樣，在pH5條件下的解離狀態(tài)易于與酶的結(jié)合。

2.4 酶用量對(duì)水解液中還原糖和總糖的影響

圖5 酶用量與還原糖和總糖的關(guān)系Fig.5 Effect of enzyme addition amount on the contents of total sugar and reducing sugar in hydrolysates

隨著Shearzyme 500L酶用量的增加，水解體系中的還原糖和總糖含量也相應(yīng)增加，當(dāng)?shù)孜镏忻赣昧窟_(dá)到50U/g之后，繼續(xù)增加酶用量，已經(jīng)不會(huì)顯著增加水解體系中的還原糖和總糖含量總量(圖5)。說(shuō)明50U/g酶用量已經(jīng)足夠充分水解溶液中的木聚糖。選擇Shearzyme 500L水解木聚糖制備低聚木糖時(shí)，以50U/g的酶用量為適宜。

低聚木糖生產(chǎn)的酶用量因底物、酶源不同而有所差異。黃家驥[14]用酶法水解玉米芯木聚糖制備低聚木糖，其工藝條件為底物中加酶量為800U/g；蔣琦霞等[16]酶水解爆破秸稈制備低聚木糖，干基中黑曲霉木聚糖酶添加量為198U/g；朱孝霖等[17]以耐熱木聚糖酶水解法制備木寡糖酶用量為100U/g，薛文通等[18]以卷須鏈霉菌(Streptomyces cirratus D-10)木聚糖酶水解堿提玉米芯木聚糖的合適酶用量為60U/g。相比之下，蔗渣木聚糖底物中Shearzyme 500L酶用量為50U/g，說(shuō)明Shearzyme 500L具有較高的酶解效率，用少量的酶就可以將蔗渣木聚糖中的可酶解性糖水解出來(lái)。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物的影響

分析水解液中木糖、木二糖與木三糖之間的比例可以發(fā)現(xiàn)，Shearzyme 500L水解蔗渣木聚糖4h，反應(yīng)體系中木三糖所占比例達(dá)到極大植，此后木三糖比例持續(xù)下降，木二糖比例則相應(yīng)上升，木糖所占比例明顯隨木三糖降低的比例而相應(yīng)升高(圖6)。這表明，Shearzyme 500L具有水解木三糖的活性，并相應(yīng)生成木二糖與木糖，但它并不能將一分子木二糖水解為兩個(gè)木糖單糖。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)產(chǎn)物中主要成分所占比例的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on the proportion of major components in hydrolysates

水解24h之后，木三糖、木二糖、木糖單糖之間的比例達(dá)到平衡，繼續(xù)延長(zhǎng)水解時(shí)間，它們之間的比例變化已經(jīng)不明顯(圖6)。木二糖是低聚木糖最主要的活性成分，木二糖含量水平是低聚木糖最重要的質(zhì)量指標(biāo)。顯然，要獲得高木二糖含量的低聚木糖產(chǎn)品，Shearzyme 500L的水解底物的時(shí)間應(yīng)達(dá)到24h。

2.6 底物質(zhì)量濃度對(duì)水解的影響

圖7 底物質(zhì)量濃度對(duì)還原糖和總糖的影響Fig.7 Effect of substrate concentration on the contents of total sugar and reducing sugar in hydrolysates

還原糖和總糖含量在2～10g/100mL的底物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨底物質(zhì)量濃度的增加而增加，但水解率卻隨著底物質(zhì)量濃度的增加而降低(圖7)。底物質(zhì)量濃度較低時(shí)，得到的還原糖和總糖含量相應(yīng)較少是容易理解的。隨著底物質(zhì)量濃度的增加水解率降低，雖然可能包括底物質(zhì)量濃度的增加，反應(yīng)體系的黏稠性增加，影響了酶、底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散以及酶與底物的接觸，從而降低了酶促反應(yīng)速度的因素，但最主要原因應(yīng)當(dāng)是反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)酶活性的抑制作用。反應(yīng)進(jìn)行到一定階段時(shí)，產(chǎn)物含量增加到一定濃度的時(shí)候，酶促反應(yīng)速率就會(huì)降低。

Shearzyme 500L水解蔗渣木聚糖結(jié)果表明，當(dāng)酶解產(chǎn)物中木糖含量達(dá)到(7.53±1.10)g/L時(shí)，就顯著抑制Shearzyme 500L活性，使底物不能水解，所以只能用較低的底物質(zhì)量濃度。酶法生產(chǎn)低聚木糖水解率一般在40%～66%[14,19-20]，相比之下，Shearzyme 500L水解3g/ 100mL底物的蔗渣木聚糖水解率可達(dá)63.1%；從圖7結(jié)果可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過(guò)3g/100mL，水解率會(huì)急劇下降，所以控制在3g/100mL為宜。為提高底物的利用率，應(yīng)找尋去除產(chǎn)物抑制的途徑。

3 結(jié) 論

Shearzyme 500L木聚糖酶水解蔗渣木聚糖的產(chǎn)物以低聚木糖為主要成分，充分水解之后產(chǎn)物中的木二糖、木三糖占總還原糖的81.5%，其中木二糖54.8%、木三糖26.7%。它是具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的低聚木糖生產(chǎn)用酶。

Shearzyme 500L耐高溫性能好，在60℃保溫2h后仍有高于96%的活性。良好的耐高溫性能有利于減少生產(chǎn)過(guò)程的微生物污染，適當(dāng)延長(zhǎng)水解時(shí)間，使底物得以充分水解。

水解副產(chǎn)物木糖不是活性成分，但能顯著抑制Shearzyme 500L活性，降低木聚糖的水解率。雖然Shearzyme 500L不能將一分子木二糖水解為兩個(gè)木糖單糖，但能水解木三糖并相應(yīng)生成木二糖與木糖。木二糖是低聚木糖最主要的活性成分，因此尋找有效手段去除副產(chǎn)物木糖，就能提高Shearzyme 500L的使用效率與底物的利用率，并獲得高木二糖含量的水解產(chǎn)物。

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Enzymatic Hydrolysis Properties of Bagasse Xylan by Xylanase Shearzyme 500L

SHI Guo-liang1,2，ZHOU Yu-heng1，ZHANG Hou-rui1,*，CAI Ai-hua1，CHEN Hai-shan1
(1. Guangxi Institute of Botany, Guilin 541006, China；2. College of Life Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China)

Xylanase Shearzyme 500L was used to hydrolyze bagasse xylan for preparing xylooligosaccharide. DNS was used to determine the contents of total sugar and reducing sugar in hydrolysates and HPLC was used to determine the compositions of hydrolysates. The optimal hydrolysis conditions were substrate concentration of 3 g/100 mL, hydrolysis pH of 5.0, hydrolysis temperature of 60 ℃, enzyme addition amount of 50 U/g and hydrolysis time of 24 h. Under the optimal hydrolysis conditions, the hydrolysis rate of bagasse xylan was approximately 63.1%, and the xylooligosaccharide in hydrolysates was up to 81.5%, which included 54.8% xylobiose and 26.7% xylotriose. Xylotriose could be hydrolyzed to xylobiose and xylose by xylanase shearzyme 500 L, but xylobiose could not be hydrolyzed to xyloses. The by-product xylose could also obviously suppress the activity of xylanase shearzyme 500 L and reduce the hydrolysis rate of bagasse xylan.

xylanase；bagasse xylan；xylooligosaccharide

Q556.2

A

1002-6630(2010)24-0102-05

2010-02-26

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(桂科自0832221)

石國(guó)良(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：gxsdsgl@126.com

*通信作者：張厚瑞(1954—)，男，研究員，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)精煉、生物轉(zhuǎn)化與功能性糖。E-mail：zh-hr@hotmail.com