酶膜生物反應(yīng)器制備抗凝血酶蛋清水解物的研究

楊萬根，程云輝，王 璋

(1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114)

酶膜生物反應(yīng)器制備抗凝血酶蛋清水解物的研究

楊萬根1,2，程云輝3，王 璋2

(1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114)

采用酶膜生物反應(yīng)器(EMBR)制備抗凝血酶蛋清水解物，并用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法優(yōu)化工藝。在0.13～0.15MPa條件下，采用L18(37×21)混合水平正交試驗(yàn)考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、溫度、濾過液流速和水解時(shí)間對(duì)蛋清水解物的抗凝血酶生物活性的影響，并用多層前饋網(wǎng)絡(luò)(BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))對(duì)EMBR酶解的過程進(jìn)行模擬和預(yù)測(cè)，獲得抗凝血酶水解產(chǎn)物的最優(yōu)制備工藝條件。結(jié)果表明，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、pH8.0、溫度55℃、濾過液流速10mL/min、水解時(shí)間4h時(shí)，產(chǎn)物的最低抗凝血酶IC50預(yù)測(cè)值為10.43mg/mL，與實(shí)測(cè)值僅相差4.03%，說明采用EMBR制備蛋清酶解物的方法可行，并經(jīng)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法優(yōu)化得到了抗凝血酶蛋清水解物的最優(yōu)制備條件。

酶膜生物反應(yīng)器；蛋清；多層前饋網(wǎng)絡(luò)(BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))；抗凝血酶活性；優(yōu)化

自1985年以來，我國(guó)雞蛋產(chǎn)量就一直位居世界首位，在2005年雞蛋產(chǎn)量已占世界產(chǎn)量的40%以上[1]。在一些食品行業(yè)中，蛋黃被用做糕點(diǎn)、月餅的原料，而蛋清常常作為廢棄物被拋棄，既污染了環(huán)境，又浪費(fèi)了寶貴的蛋白質(zhì)資源。因此，開發(fā)和利用豐富的蛋清資源具有重要意義。蛋清是含有10.6%蛋白質(zhì)的水溶液，當(dāng)前開發(fā)蛋清的一種新途徑是以蛋清蛋白質(zhì)為原料，以生物酶解的方法制備具有一定生物活性的水解物用于各種運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)品和保健食品中[2-3]。酶膜生物反應(yīng)器(enzymatic membrane bioreactor，EMBR)是將膜過濾和酶催化反應(yīng)結(jié)合在一起的系統(tǒng)，可以用于連續(xù)制備小分子蛋白質(zhì)水解物，比目前常用的批次酶解法具有節(jié)省酶成本、底物轉(zhuǎn)化率高及產(chǎn)物品質(zhì)均一等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，是一種比較先進(jìn)的方法，已被應(yīng)用于制備各種

蛋白質(zhì)來源的水解物[6-7]。

EMBR制備水解物的過程受到較多因素的影響，一般的優(yōu)化方法例如響應(yīng)面分析法，因?qū)嶒?yàn)工作量太大而不適合對(duì)E M B R酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。M a t l a b是Mathworks公司研制的一套高性能的數(shù)值計(jì)算和可視化軟件，其中的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱是用Matlab語(yǔ)言開發(fā)出來的諸多工具箱之一，網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)者可以根據(jù)自己的需要去調(diào)用工具箱中有關(guān)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)與訓(xùn)練函數(shù)，從而提高效率和解題質(zhì)量。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)在多因素工藝優(yōu)化方面具有降低工作量的優(yōu)勢(shì)[8]，如趙武奇等[9]用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化出最佳的蘋果籽油乳化工藝參數(shù)；李興江等[10]用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析秸稈水解液經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的工藝，具有抗凝血酶活性的蛋白水解物可以用于防治心血管疾病病人發(fā)生血栓病，在醫(yī)藥和保健食品行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用EMBR制備抗凝血酶蛋清水解物，并設(shè)計(jì)3層前饋網(wǎng)絡(luò)(BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))，對(duì)制備過程進(jìn)行模擬和預(yù)測(cè)，最終獲得EMBR制備抗凝血蛋清水解物的最優(yōu)生產(chǎn)工藝，為產(chǎn)業(yè)化EMBR酶法制備蛋清水解物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋清粉 自制；Protease N“Amano” Amano酶制劑公司；凝血酶(牛血清)、纖維蛋白原(牛血清) Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾系統(tǒng)：配有BiomaxTM10聚醚砜超濾膜膜包(截留面積0.1m2，截留相對(duì)分子質(zhì)量104)、PelliconTM-2 Mini膜夾具、Millipore蠕動(dòng)泵 美國(guó)Millipore公司；Plus384酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；夾套玻璃反應(yīng)器無錫湖景玻璃儀器商店。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝

酶解工藝如圖1所示。配好2L一定濃度的蛋清溶液，調(diào)節(jié)pH10，迅速升溫至85℃并恒溫30min；反應(yīng)器夾套中的水溫預(yù)先升至水解溫度，將熱處理好的1L蛋清溶液轉(zhuǎn)入2L容積的反應(yīng)器中，用強(qiáng)力攪拌機(jī)在500r/min速度條件下攪拌，使蛋清溶液冷卻到水解溫度并恒定。其余蛋清溶液作補(bǔ)液，在60℃恒溫水浴中保溫。調(diào)節(jié)反應(yīng)器中的蛋清溶液達(dá)到預(yù)定的水解pH值，加入Protease N蛋白酶開始水解。在水解初始0.5h內(nèi)，關(guān)閉超濾裝置，使反應(yīng)在反應(yīng)器中進(jìn)行，之后開啟超濾裝置。為了避免泵入水解液溫度超過50℃而對(duì)膜包造成損害，超濾裝置前加有冷凝裝置；進(jìn)樣壓力設(shè)定在0.13～0.15MPa；水解過程中添加蛋清補(bǔ)液使反應(yīng)液體積不變，并滴加1mol/L的NaOH溶液使反應(yīng)液pH值恒定；到達(dá)預(yù)定水解時(shí)間后，終止反應(yīng)。

圖1 蛋清酶解工藝示意圖Fig.1 Sketch map showing the egg white protein hydrolysis in an enzymatic membrane reactor

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期研究基礎(chǔ)上[12]，采用L18(37×21)混合水平正交試驗(yàn)考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、pH值(C)、水解時(shí)間(D)、濾過液流速(E)、溫度(F)對(duì)水解物抗凝血酶活性的影響，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the L18(37×21) mixed-level orthogonal array design

1.3.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)及訓(xùn)練

選用表1所得的正交試驗(yàn)結(jié)果中18組試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為學(xué)習(xí)樣本，6個(gè)酶解工藝參數(shù)作為輸入，抗凝血酶活性指標(biāo)為輸出。以Matlab語(yǔ)言中的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱為工具進(jìn)行編程，選用6個(gè)輸入神經(jīng)元(X1～X6)，18個(gè)隱含層神經(jīng)元(P1～P18)和1個(gè)輸出神經(jīng)元(y)的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(圖2)。為方便計(jì)算，首先將參數(shù)進(jìn)行歸一化處理，分別用1～3代表試驗(yàn)中各因素的3個(gè)水平(表1)。隱含層采用對(duì)數(shù)S型傳遞函數(shù)(logsig)，輸出層采用純線性函數(shù)(p u r e l i n)，學(xué)習(xí)函數(shù)為帶動(dòng)向量的B P學(xué)習(xí)函數(shù)(l e a r n g d m)，訓(xùn)練函數(shù)為成比例的共軛梯度算法(trainscg)，設(shè)定指標(biāo)的訓(xùn)練均方差為10-2，完成訓(xùn)練擬合步數(shù)小于10000步，組成訓(xùn)練集對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練。

圖2 BP結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Architecture for BP neural networks

1.3.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)酶解過程的模擬和優(yōu)化

利用訓(xùn)練好的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)考察試驗(yàn)中重要因素對(duì)抗凝血酶活性的影響，并經(jīng)過Matlab數(shù)值仿真得到最大輸出條件，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用Lowry法[13]測(cè)定。

1.3.6 抗凝血酶活性測(cè)定

采用酶標(biāo)儀法[14]測(cè)定。水解物的抗凝血酶活性用IC50值來表示，其定義為抑制50%的凝血酶活力所需的蛋清水解物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 L18(37×21)混合水平正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Arrangement of the L18(37×21) mixed-level orthogonal array design and experimental results of the antithrombin activity of EWH

蛋清中含有多種對(duì)蛋白酶有抑制作用的物質(zhì)，如卵類黏蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制物、卵抑制物和卵固蛋白等[15]。由于這些抑制物的存在，導(dǎo)致水解蛋清所需的酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大或者水解度不理想，因此必須在EMBR酶解蛋清前對(duì)蛋清進(jìn)行熱處理，以使其中的蛋白酶抑制物發(fā)生變性或部分變性而失去抑制能力，提高酶解效果。對(duì)蛋清熱處理的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以通過調(diào)節(jié)pH值，在熱處理中形成低黏性的溶液，使蛋清呈現(xiàn)出原先沒有的良好流體性質(zhì)，以有利于蛋清物料在管路中的傳送、超濾和水解。已有研究表明，調(diào)節(jié)蛋清pH10進(jìn)行30min的熱處理能達(dá)到以上目的，因此試驗(yàn)中采用該條件進(jìn)行水解前的熱處理[16-17]。

熱處理后的蛋清進(jìn)行酶解的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，極差分析結(jié)果見表3。對(duì)表2中各因素的R值大小排序可知因素的重要性次序，但是，各因素的效應(yīng)是否真正對(duì)試驗(yàn)有影響，還需將其R值與空列的R值比較，當(dāng)因素的R值大于空列R值時(shí)才能說明該因素的效應(yīng)存在。由表3顯示，水解時(shí)間和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的R值小于空列的R值，故它們的影響效應(yīng)不明顯，由此因素的重要性排序?yàn)闉V過液流速＞酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值＞溫度。由Ki值可知，對(duì)抗凝血酶活性而言，EMBR制備蛋清水解物的最佳工藝條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、pH8.0、水解時(shí)間4h、濾過液流速10mL/min、溫度55℃。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析Table 3 Range analysis for the antithrombin activity of EWH with various hydrolysis conditions

2.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練

圖3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練Fig.3 Training of BP artificial neural networks

利用Matlab的神經(jīng)工具箱對(duì)圖2的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)

行訓(xùn)練，結(jié)果顯示在迭代步數(shù)為2974時(shí)，均方差為0.00855164，達(dá)到了預(yù)定的均方差小于10-2(圖3)，因此所建的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠在規(guī)定的跌代步數(shù)內(nèi)達(dá)到預(yù)期的訓(xùn)練目標(biāo)。

2.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)酶解過程的優(yōu)化

由極差分析結(jié)果可知，濾過液流速、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值對(duì)水解物的抗凝血酶活性有重要影響，但考慮到實(shí)際工作中濾過液流速和pH值的影響更為重要，因此使用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)考察濾過液流速與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)抗凝血酶活性的影響，進(jìn)而確定濾過液流速、p H值和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳工藝參數(shù)，它們對(duì)抗凝血酶活性的影響見圖4、5。

圖4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)考察pH值與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)抗凝血酶活性的影響Fig.4 Effects of pH and substrate concentration on the antithrombin activity of EWH investigated using BP artificial neural networks

圖5 BP人工網(wǎng)絡(luò)考察濾過液流速與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)抗凝血酶活性的影響Fig.5 Effects of filtration flow rate and substrate concentration on the antithrombin activity of EWH investigated using BP artificial neural networks

由圖4可知，pH值和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)抗凝血酶活性存在影響，在pH8.0、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%時(shí)有抗凝血酶活性的最低IC50值。由圖5可知，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和濾過液流速同樣對(duì)抗凝血酶活性存在影響，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、濾過液流速10mL/min時(shí)有最低IC50值。經(jīng)Matlab數(shù)值仿真，當(dāng)pH8.0、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、濾過液流速10mL/min、溫度55℃、水解時(shí)間4h時(shí)，得到BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的最低抗凝血酶活性IC50值為10.43mg/mL。經(jīng)相同條件實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，產(chǎn)物的IC50值為10.85mg/mL，與預(yù)測(cè)值相差4.03%。從預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的誤差可以看出，訓(xùn)練得到的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有較好的預(yù)測(cè)性，可作為此水解過程的模擬和預(yù)測(cè)工具。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)EMBR制備蛋清蛋白水解物的各參數(shù)中，濾過液流速、p H值、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溫度對(duì)抗凝血酶活性存在影響效應(yīng)，并且利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)EMBR水解過程進(jìn)行了控制和仿真，實(shí)現(xiàn)了EMBR制備蛋清水解物的模擬和預(yù)測(cè)，為今后EMBR制備蛋清水解物的中試實(shí)驗(yàn)提供參考。

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Use of Artificial Neural Networks for the Optimization of Preparation of Egg-white Hydrolysate with Antithrombin Activity in an Enzymatic Membrane Bioreactor

YANG Wan-gen1,2，CHENG Yun-hui3，WANG Zhang2
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；3. School of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

An enzymatic membrane reactor designed based on the combination of membrane filtration and Protease N Amanocatalyzed hydrolysis was used to prepare egg-white hydrolysate (EWH) with antithrombin activity. A L18(37×21) mixed-level orthogonal array design was used to investigate the effects of substrate concentration, enzyme dosage, pH, temperature, filtration flow rate and length of hydrolysis on the antithrombin activity of EWH. This was followed by the stimulation and predication of EW hydrolysis using back propagation (BP) neural networks to obtain the optimal values of the above parameters. The results showed that the predicted value of IC50of EWH obtained under the following optimized conditions: substrate concentration 1%, enzyme dosage 1%, filtration flow rate 10 mL/min, and length of hydrolysis 4 h was 10.43 mg/mL, 4.03% lower then the actual value. This demonstrates good reliability of BP neural networks in optimizing egg white protein hydrolysis.

enzymatic membrane bioreactor；egg white；back propagation (BP) neural network；antithrombin activity；optimization

TS253.9

A

1002-6630(2010)10-0159-04

2009-08-07

楊萬根(1974—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)在食品中的應(yīng)用。E-mail：yangwangen08@163.com