水產品金黃色葡萄球菌檢驗結果不確定度的評定

王李寶，凌 云，劉綠葉，沈 輝，萬夕和

(江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007)

水產品金黃色葡萄球菌檢驗結果不確定度的評定

王李寶，凌 云，劉綠葉，沈 輝，萬夕和

(江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007)

目的：評定水產品金黃色葡萄球菌檢驗結果的不確定度。方法：采用統(tǒng)計學方法對日常檢驗數據進行不確定度評定。結果：擴展不確定度為0.1，適合于每一個水產品樣本的檢測結果。結論：利用日常檢驗數據評定金黃色葡萄球菌檢驗結果的不確定度是可行的。

水產品；金黃色葡萄球菌；不確定度評定

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種引起人類和動物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一[1-2]。為了確保金黃色葡萄球菌檢驗結果的準確性和可靠性，嘗試將其檢驗結果不確定度的評定引入到日常的檢驗工作中。而測量不確定度是衡量測試結果準確性和可靠性的重要參數。測量結果不確定度評定是實驗室質量體系的重要組成部分，是測量實驗室質量管理的重要內容，也是ISO/IEC17025的要求。尤其當不確定度影響到與規(guī)范限度的符合性時，測量不確定度的信息顯得特別重要[3-4]。檢驗結果的可用性很大程度上取決于測量結果不確定度的大小。所以，檢驗結果不確定度的評定對實驗方法的可靠性有科學的指導意義[5-6]。

本研究采用GB/T 4789.37—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗：金黃色葡萄球菌計數》中的第一法[7]對本實驗室抽檢的南通地區(qū)2007～2009年的水產品(干紫菜)金黃色葡萄球菌進行檢驗，找出影響輸入量的各種因素，計算各種不確定度分量，計算合成不確定度和擴展不確定度，從而對檢驗結果的質量給出定量的說明，以確定檢驗結果的可信程度，進而掌握類似檢驗方法的測量不確定度的評定程序。

1 評定方法的選擇

假設檢驗樣品是均勻的，在實驗室內由相同人員在同一檢驗環(huán)境按同一檢驗標準進行檢驗。鑒于檢驗過程對樣品進行10倍稀釋，因此對檢出金黃色葡萄球菌的檢驗結果取對數，再用統(tǒng)計學方法(A類)評定此類樣品的金黃色葡萄球菌計數檢驗結果的不確定度。

2 檢驗方法和檢驗流程

2.1 試劑與儀器

本研究中所采用的培養(yǎng)基均采購于北京陸橋技術有限責任公司，所用主要儀器有恒溫培養(yǎng)箱和電子天平等，均符合GB/T 4789.37—2008計數中試劑和儀器的要求。

2.2 樣品中金黃色葡萄球菌的計數

根據GB/T4789.37—2008計數中第一法進行檢驗。

2.3 結果計算

根據GB/T 4789.37—2008中第一法的計算方法。

3 不確定度分量的主要來源及分析

檢驗結果的不確定度來源如圖1所示。

圖1 檢驗結果的不確定度來源Fig.1 Analysis of source of measurement uncertainty in the enumeration of Staphylococcus aureus in aquatic products

4 不確定度的評定

4.1 樣品稱量過程產生的不確定度

本實驗室嚴格依照GB/T 4789.1—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗：總則》[8]規(guī)定，在無菌條件下將樣品充分混勻后隨機取樣，均質袋拍擊速度和拍擊時間嚴格按照GB/T 4789.37—2008中規(guī)定執(zhí)行。

GB/T 4789.37—2008要求準確稱量25g被測樣品，本實驗室采用精度為0.01g的電子天平，根據JJG1036—2008《中華人民共和國計量檢定規(guī)程：電子天平》規(guī)定[9]，該準確級(Ⅱ)的天平在0～500g稱量范圍的MPE為±0.5g，天平線性MPE為矩形分布，天平稱量引入的不確定度為：

4.2 樣品稀釋過程中儀器所產生的不確定度

樣品稀釋采用1mL移液器和10mL移液管進行梯度稀釋。JJG646—2006《中華人民共和國計量檢定規(guī)程移液器檢定規(guī)程》[10]規(guī)定：1000μL可調移液器吸取1mL時容量允差為±1.0%，取矩形分布；JJG196—2006《中華人民共和國計量檢定規(guī)程常用玻璃量器》[11]規(guī)定：20℃時10mL移液管(A級)的容量允差為±0.05mL，取矩形分布。因此，由可調移液器及吸管導致的不確定度分別為：

因此，樣品稀釋過程中所產生的不確定度為：

本實驗是在20℃的條件下進行的，因此，容量瓶和溶液溫度與校準時溫度不同引起的不確定度為零。當溫度不為20℃時，必須考慮溫度對體積的影響。

4.3 樣品重復性檢驗的不確定度

在相同條件下，對同一份金黃色葡萄球菌污染的樣品進行了10次獨立檢驗，檢驗結果為1.25×102、1.3 ×102、1.25×102、1.3×102、1.4×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102CFU/g。為了計算不確定度的方便將上述結果均取對數，相應結果為2.10、2.11、2.10、2.11、2.15、2.10、2.10、2.10、2.10和2.10。金黃色葡萄球菌計數結果的對數算術平均值為：

4.4 培養(yǎng)基儲存條件產生的不確定度

表1 BP培養(yǎng)基在不同貯存條件下對金黃色葡萄球菌檢測結果的影響Table 1 Effect of storage conditions of Barid-Parker culture medium on the enumeration of Staphylococcus aureus

即使由同一廠家生產的Barid-Parker培養(yǎng)基因儲存條件和時間不同，導致金黃色葡萄球菌的檢出率不同[12]。本實驗室按照GB/T 4789.37—2008附錄A.2規(guī)定配制Barid-Parker培養(yǎng)基，在48h內對同一金黃色葡萄球菌污染樣品使用不同貯存條件下(室溫和冰柜貯存)的Barid-Parker培養(yǎng)基平板進行了檢測，檢測結果見表1。

室溫(18～22℃)條件下，金黃色葡萄球菌檢出率算術平均值為：

4.5 肉眼讀數的偏差產生的不確定度

對于平板上超過150個菌落，本實驗室檢驗人員通常采用兩種計數方式：一、直接計數，即逐個點數平板上的可疑菌落數，二、將平板等分四等分，點數其中一個區(qū)域的可疑菌落數，再乘以4倍得菌落總數。本實驗室采用受金黃色葡萄球菌污染的不同樣品進行了20次檢驗，采用上述兩種讀數方法，檢驗結果見表2。

表2 不同方法的金黃色葡萄球菌檢測結果Table 2 Results of enumeration of Staphylococcus aureus obtained by different colony counting methods

20次不同計數方式，等分計數結果/直接計數結果的平均值為：

4.6 血漿凝固酶陽性比例產生的不確定度

由于可疑菌落需要進行血漿凝固酶實驗來最終判定金黃色葡萄球菌的比例，故血漿凝固酶實驗也可產生不確定度。根據2008年至2009年本實驗室統(tǒng)計，共計完成血漿凝固酶驗證實驗135次，其中1次陽性率為80%，其余驗證結果陽性率均為100%，則135次驗證實驗金黃色葡萄球菌陽性率平均值為：

單次檢驗的不確定度為：

所以，由血漿凝固酶實驗引入的不確定度為：

4.7 樣品的合成不確定度

4.8 擴展不確定度

在沒有特殊要求的情況下，按一般慣例，測量結果的擴展不確定度包含因子k取2，則相對擴展不確定度為：

4.9 結果報告

當檢驗結果以對數的平均值表示時，其取值區(qū)間分布于±0.21。當檢測結果以平均值表示時，相對于對數值的取值再取反對數得其取值區(qū)間分布。

5 結 論

采用GB/T 4789.37—2008中第一法檢驗水產品中金黃色葡萄球菌，在檢出金黃色葡萄球菌樣品的檢驗結果中，其對應的計數結果對數值的擴展不確定度為0.1。該樣品金黃色葡萄球菌的檢驗計數結果為：ω＝10(2.11±0.21)CFU/g，即ω＝(79～209)CFU/g。

經過本實驗室對金黃色葡萄球菌檢驗結果分析得出，按照GB/T 4789.37—2008中第一法中的檢驗方法和實際操作，此次檢驗結果的不確定度主要來源是：肉眼讀數的偏差、培養(yǎng)基貯存條件、樣品稱量過程、稀釋過程等因素。

對各不確定度分量進行分析和計算表明，肉眼讀數偏差產生的不確定度分量最大，其次是培養(yǎng)基貯存條件引入的不確定度，再次是血漿凝固酶驗證實驗和稱量引入的不確定度，相對較小的是樣品稀釋過程和實驗重復性引入的不確定度。

因此，以后對于樣品金黃色葡萄球菌的檢驗，盡量采用逐個點數可疑菌落，并在盡可能短的時間內使用所配制的Barid-Parker培養(yǎng)基，是確保檢測數據準確、可靠的有效手段。

[1]雷柞榮. 葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病[M]. 北京: 中國科學技術出版社, 1992.

[2]崔京輝, 李達, 王麗萍, 等. 2004-2006年北京市西城區(qū)食品中主要致病菌株檢測結果及分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008, 18(6): 1163-1165.

[3]許如蘇, 馬少玲, 陳冠武. 奶制品霉菌和酵母計數檢驗結果不確定度的評定[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2007, 17(7): 1247-1248.

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[7]中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所. GB/T 4789.37—2008食品衛(wèi)生微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌計數[S]. 北京: 中國標準出版社, 2009.

[8]中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所. GB/T 4789.1—2008 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 總則[S]. 北京: 中國標準出版社, 2009.

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[10]全國流量容量計量技術委員會. JJG646—2006中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程 移液器[S]. 北京:中國計量出版社, 2007.

[11]全國流量容量計量技術委員會. JJG 196—2006中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程 常用玻璃量器[S]. 北京: 中國計量出版社, 2007.

[12]張文利, 劉月芳. BP培養(yǎng)基經不同條件貯存后對金黃色葡萄球菌檢測結果的影響[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2005, 15(5): 620-621.

Evaluation of Measurement Uncertainty in the Enumeration of Staphylococcus aureus in Aquatic Products

WANG Li-bao，LING Yun，LIU Lu-ye，SHEN Hui，WAN Xi-he
(Institute of Oceanology and Marine Fisheries, Nantong Jiangsu 226007, China)

To make an evaluation on measurement uncertainty in the enumeration of Staphylococcus aureus in aquatic products, the sources of measurement uncertainty were analyzed, each uncertainty component was modeled and an integrated uncertainty model as a function of all components was established and expanded. The expanded uncertainty was calculated to be 0.1. The evaluation is a good fit for each aquatic product sample.

aquatic products；Staphylococcus aureus；uncertainty evaluation

TS254.1

A

1002-6630(2010)10-0212-04

2009-08-14

江蘇省社會發(fā)展科技計劃(面上)項目(BS2006029)

王李寶(1978—)，男，助理研究員，碩士，主要從事海洋微生物學研究。E-mail：zebra_w@126.com