周麗娟,劉清飛,陳曦,王義明,羅國安(1.鄭州市中心醫(yī)院藥劑科,鄭州市450007;.清華大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究院,北京市 100084)
紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是一種萜類化合物,最早由Ghamande S等[1]從短葉紫杉的樹皮中分離并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu),是近年來療效顯著的抗癌藥物之一。它能促進(jìn)微管蛋白聚合、微管裝配,防止解聚,使微管穩(wěn)定,并能抑制細(xì)胞分裂增殖,臨床可用于治療卵巢癌、乳腺癌、子宮癌、肺癌、食管癌、前列腺癌等[2]。由于紫杉醇水溶性極差(約0.001 g·L-1),口服幾乎不吸收,目前臨床應(yīng)用的注射劑是以聚氧乙烯氫化蓖麻油-無水乙醇(50∶50,V/V)制成的無色黏稠液體,臨床使用時(shí)經(jīng)氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注。但制劑中聚氧乙烯氫化蓖麻油極易引起過敏反應(yīng)和低血壓,還可導(dǎo)致PVC包裝中增塑劑的溶出,使毒性增加,稀釋后宜析晶,從而限制了臨床的應(yīng)用[3,4]。
微乳可增加難溶性藥物的溶解度,是難溶性藥物的理想載體。研究中筆者改變了傳統(tǒng)制備微乳的方法,采用制備膠束溶液或脂質(zhì)體的薄膜分散法制備了紫杉醇O/W微乳(PTX ME),并對(duì)其處方、工藝及有關(guān)理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。
Agllent 1100型高效液相色譜儀,包括DAD檢測(cè)器(美國安捷倫公司);TEM-philips Tecnai 20型透射電鏡(荷蘭飛利浦公司);Zetasizer Nano ZS90型激光粒度散射儀(英國馬爾文公司);BALZERS BAF-400D型冷凍蝕刻儀(列支敦士登公國Balzers公司);XS105型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);VDRTEX-5型旋渦混合器(江蘇海門其林貝爾儀器公司);RE-5285A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SPX-250型微電腦恒溫恒濕箱(上海特迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SHH-100GD型強(qiáng)光照射試驗(yàn)箱(重慶永生試驗(yàn)儀器廠)。
PTX原料(浙江海正藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):20070601,純度:98.63%);PTX ME(筆者自制,批號(hào):071201、071202、071203,規(guī)格:10 mL∶30 mg);炔諾酮對(duì)照品(NTD ,批號(hào):100053-200204)、PTX對(duì)照品(批號(hào):100382-200301)均由中國藥品生物制品檢定所提供;聚氧乙烯醚(ELP)、泊洛沙姆188(德國Basf公司);卵磷脂(S-100)、中碳鏈甘油酯(MCT)、橄欖油(德國Lipoid公司);注射用大豆油(江西金海棠藥用油公司);維生素E(VE,廣州白云山制藥總廠);脫氧膽酸鈉(美國Sigma公司);無水檸檬酸(AR級(jí),維坊英軒實(shí)業(yè)有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司);其余試劑均為分析純,水為注射用水。
2.1.1 溶劑的選擇[5]分別取盛有約1 g的各種油(Oil)、表面活性劑(SA)、助表面活性劑(CoSA)的試管,分別逐漸加入PTX,渦旋12 h,置于60℃水浴中超聲振蕩8 h,室溫平衡24 h,若PTX溶解,則在溶劑中再逐漸加入PTX,直至達(dá)到飽和,比較PTX在各種溶劑中的相對(duì)溶解度,選擇制備PTX ME適宜的溶劑??芍琍TX 在 MCT(Oil)、ELP(SA)、無水乙醇(CoSA)中溶解度最大。PTX在不同溶劑中的相對(duì)溶解度見表1。
表1 PTX在不同溶劑中的相對(duì)溶解度(37℃)Tab 1 Relative solubility of paclitaxel in different solvents(37℃)
2.1.2 PTX ME的處方優(yōu)選 按表1的定性測(cè)定結(jié)果,選擇MCT作為油相,ELP作為SA;處方中為了減少ELP的用量,同時(shí)加入S-100作為SA,無水乙醇為CoSA;為了防止處方中的S-100氧化,加入VE作為抗氧劑;加入DOC-Na有助于提高PTX的溶解度,也可作為輔助SA。各處方中將VE的量固定為0.5%,S-100的量固定為5%(處方規(guī)格:10 mL∶30 mg)。參考文獻(xiàn)[5,6]中繪制的偽三元相圖,選取在微乳區(qū)域的幾個(gè)處方,制備PTX ME,以制劑的外觀性狀、稀釋后放置的穩(wěn)定性、粒徑作為評(píng)價(jià)指標(biāo),選出最優(yōu)處方。PTX ME處方優(yōu)化見表2(配伍后穩(wěn)定性指加5%葡萄糖溶液稀釋10倍后溶液的穩(wěn)定性)。
表2 PTX ME處方優(yōu)化Tab 2 Prescription optimization of PTX ME
2.1.3 PTX ME的制備 稱取處方量的PTX、ELP、S-100、DOC-Na、MCT、VE,置于圓底燒瓶中,再加入處方量的無水乙醇,70℃水浴加熱使全部溶解,40℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸干,再于40℃真空干燥箱中干燥24 h,加入處方總量3%的無水乙醇和少量注射用水,磁力攪拌使其全溶,在磁力攪拌下緩緩滴加注射用水至全量的80%時(shí),用適量的無水檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0,加入注射用活性炭,吸附30 min,過濾脫炭,補(bǔ)加注射用水至全量,無菌條件下灌封于安瓿中,即得。結(jié)果表明,處方2、3配伍后穩(wěn)定時(shí)間長,均能滿足臨床用藥要求,但處方3中ELP的用量相對(duì)較大,過敏反應(yīng)強(qiáng),故選擇2號(hào)為最優(yōu)處方。
2.2.1 外觀性狀 制備的PTX ME為澄明淡黃色液體。
2.2.2 pH值 按2005年版《中國藥典》(二部)附錄pH值測(cè)定法,測(cè)定其pH值為4.83。
2.2.3 形態(tài)學(xué)[7]研究 采用冷凍蝕刻技術(shù)[5]對(duì)PTX ME進(jìn)行冷凍處理,于透射電鏡下觀察并照相,微乳乳滴呈圓球形,分布均勻。PTX ME冷凍蝕刻電鏡照片見圖1。
2.2.4 粒徑及分布考察[8,9]取PTX ME適量,加5%的葡萄糖注射液或0.9%的氯化鈉注射液分別稀釋10倍,用激光粒度散射儀測(cè)定微乳的粒徑及其分布。結(jié)果表明,PTX ME的平均粒徑分別為20.8 nm和20.7 nm,多分散指數(shù)為0.084和0.077,呈Gauss分布,約90%的粒子分布在11~32 nm。PTX ME經(jīng)5%葡萄糖注射液稀釋后的粒徑分布見圖2。
2.2.5 載藥量和包封率的測(cè)定 (1)色譜條件:色譜柱為Agilent Tc-C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水(35∶35∶30),流速為1.0 mL·min-1,檢測(cè)波長為227 nm,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL。方法學(xué)[10、11]表明,PTX空白微乳不干擾測(cè)定;PTX與NTD的分離度為4.98。線性方程為f=0.058 3C+0.011 7(r=0.999 9,n=6)。測(cè)定日內(nèi)8 h和日間3 d的精密度,RSD分別為0.45%(n=6)和0.64%(n=6);平均回收率為99.80%,RSD=0.77%(n=9)??梢?,方法的精密度、回收率均較好。PTX的HPLC圖見圖3。
(2)包封率測(cè)定[12]:參照2005年版《中國藥典》微囊、微球與脂質(zhì)體指導(dǎo)原則的要求進(jìn)行本品的包封率測(cè)定。①洗脫曲線的考察:將葡聚糖凝膠G50用蒸餾水充分溶脹后裝柱(柱高∶內(nèi)徑=6∶1),洗脫液為蒸餾水。精密量取微乳(取PTX ME注射液,加5%葡萄糖注射液稀釋10倍)0.5 mL上柱,每1 mL收集1份樣品,然后按“2.2.5(1)”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果,微乳于6~13 mL之間流出,游離藥物于16 mL開始流出,微乳與游離藥物能完全分開。②柱層析方法的回收率考察:取微乳0.5 mL上柱后,13 mL前用蒸餾水洗脫,流出13 mL以后用20%乙醇溶液洗脫,收集25 mL內(nèi)的洗脫液,加甲醇定容至25 mL。然后按“2.2.5(1)”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定洗脫后的藥物總量(W),并測(cè)定原上樣0.5 mL微乳中含有的藥物總量(W0),按下式計(jì)算:柱回收率(%)=W/W0×100%。分別按上法上樣0.4、0.5、0.6 mL,結(jié)果,柱回收率分別為99.31%、98.89%、97.11%(n=3),表明該方法具有較高的回收率。③包封率的測(cè)定:按“2.2.5(2)①”項(xiàng)下方法,收集微乳部分的洗脫液,加甲醇定容至25 mL,按“2.2.5(1)”項(xiàng)下色譜條件,測(cè)定收集的流出液中的藥物總量W;取同批樣品測(cè)定0.5 mL微乳中含有的藥物總量W0;包封率(%)=W/W0×100%。載藥量和包封率的測(cè)定結(jié)果見表3。
表3 載藥量和包封率的測(cè)定結(jié)果(±s,n=3)Tab 3 Drug-loading rate and encapsulated efficiency of PTX ME(±s,n=3)
表3 載藥量和包封率的測(cè)定結(jié)果(±s,n=3)Tab 3 Drug-loading rate and encapsulated efficiency of PTX ME(±s,n=3)
批號(hào)71201 71202 71203包封率/%97.03±2.54 97.89±1.68 96.24±2.74載藥量/g·L-1 3.032±0.004 2.985±0.003 3.015±0.004
2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) (1)配伍試驗(yàn):PTX ME在臨床使用時(shí),須用5%葡萄糖注射液或0.9%氯化鈉注射液稀釋后靜脈滴注,因此筆者進(jìn)行配伍試驗(yàn)觀察其穩(wěn)定性。結(jié)果,配伍后12 h內(nèi)一直呈略帶乳光的澄清透明溶液,含量、pH值、平均粒徑均無明顯變化,表明該制劑在12 h內(nèi)穩(wěn)定。(2)影響因素考察:①光照試驗(yàn):取PTX ME注射液(批號(hào):071201),置于60℃恒溫箱中,4 ℃、光照(4 000~5 000 Lx)放置10 d,分別于0、5、10 d末取樣測(cè)定。②凍融試驗(yàn):將樣品置于-4℃2 d,再放置于40℃2 d,即凍融1次,連續(xù)循環(huán)3次,考察外觀、pH值、載藥量、粒徑、有關(guān)物質(zhì)[13]。微乳除了在60℃和40℃試驗(yàn)條件下有關(guān)物質(zhì)略有增加外,其他條件各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化,表明PTX ME受溫度影響較大,高溫貯藏不穩(wěn)定,應(yīng)低溫放置。PTX ME的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4。
表4 PTX ME的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab 4 Stability of PTX ME(n=3)
研究中選取的輔料均可供注射用;且選取的最優(yōu)處方中ELP的用量只有3%,相對(duì)于市售的PTX注射液(用量為50%)減少了94%,極大降低了過敏反應(yīng)的發(fā)生率。
處方中加入的S-100有利于PTX和形成微乳乳滴的穩(wěn)定性。DOC-Na的加入增加了膜的穩(wěn)定性和PTX的溶解性,阻止了PTX的析出,而且毒副作用小,廣泛用于乳劑型注射劑制備的使用中[14]。筆者將常用的制備脂質(zhì)體和膠束的薄膜分散法和微乳制備方法相結(jié)合應(yīng)用于制備微乳,突破了微乳傳統(tǒng)的制備方法,擴(kuò)展了新技術(shù)的應(yīng)用范圍,這將為其它藥物微乳的制備提供參考。
色譜條件優(yōu)選中,經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)[13]的流動(dòng)相,PTX的出峰時(shí)間太慢,保留時(shí)間約30 min。通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例,最終確定流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水(35∶35∶30),PTX和NTD的出峰時(shí)間可控制在10 min內(nèi),且能達(dá)到很好的分離,能節(jié)省分析時(shí)間,提高分析效率。
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