PCR檢測(cè)技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

董安珍

聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction）簡(jiǎn)稱(chēng)PCR，是20世紀(jì)80年代中期Cetus公司RaryB.Mullis等人發(fā)明的一種體外酶促基因擴(kuò)增技術(shù)。它是在體外模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程，利用人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物，分別在靶DNA序列的兩端與兩條模板鏈分端互補(bǔ)的物性經(jīng)過(guò)DNA變性，模板一引物復(fù)性和在taqDNA聚合酶催化下引物鏈的延伸反應(yīng)，如此經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸約30個(gè)循環(huán)，就可能在短時(shí)間內(nèi)將靶DNA擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍作為分子生物學(xué)方法。PCR法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)，是檢測(cè)致病菌的發(fā)展方向。

1 常規(guī)PCR技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中存在的問(wèn)題

常規(guī)PCR技術(shù)在食源性致病微生物檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快、簡(jiǎn)便、高效等特點(diǎn)，為食品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持。但是在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些不足的地方：（1）食品中的一些糖類(lèi)、酸類(lèi)物質(zhì)及油脂等會(huì)干擾Taq聚合酶的作用，影響PCR反應(yīng)的正常進(jìn)行。（2）在食源性致病微生物檢測(cè)過(guò)程中，可能從環(huán)境及中間處理環(huán)節(jié)帶來(lái)一些潛在的PCR反應(yīng)抑制劑和一些其他物質(zhì)，影響PCR反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。（3）引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。（4）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性，可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

2 不同PCR技術(shù)的特點(diǎn)

常規(guī)PCR技術(shù)有其不足之處，不能滿(mǎn)足致病菌檢測(cè)的快速準(zhǔn)確的要求。為了提高檢測(cè)效率，根據(jù)PCR原理使用了如下技術(shù)應(yīng)用于微生物的快速檢測(cè)中。

2.1 RT-PCR技術(shù)（Real-timePCR）

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)保留了常規(guī)PCR檢測(cè)的特異性和敏感性，整個(gè)過(guò)程由電腦控制，從加樣到結(jié)果只需要2h左右，可同步完成多個(gè)樣品的擴(kuò)增及定量，適宜于大批樣品的檢測(cè)處理，極大地提高了檢測(cè)效率，為食品污染的監(jiān)測(cè)和食物中毒事件的快速反應(yīng)提供了技術(shù)支持。盡管實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)比較昂貴，但由于其能對(duì)樣品中細(xì)菌的污染程度進(jìn)行定性及定量分析，且靈敏度高于傳統(tǒng)PCR，更易于自動(dòng)化，必然會(huì)成為細(xì)菌檢測(cè)的常規(guī)手段。

2.2 熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。它克服了傳統(tǒng)PCR易污染、假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀(guān)、可靠，重復(fù)性、特異性好，靈敏度高，可定量等優(yōu)點(diǎn)?？赏ㄟ^(guò)電腦軟件實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線(xiàn)檢測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程得到最終檢測(cè)結(jié)果，而無(wú)需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物再次檢測(cè)，從而避免了污染。熒光定量PCR還可以實(shí)現(xiàn)一管多檢，同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)項(xiàng)目。熒光定量PCR技術(shù)的這些特點(diǎn)使得它在食品中進(jìn)行病原檢測(cè)和疫病監(jiān)測(cè)時(shí)具有其他檢測(cè)方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性，因而成為越來(lái)越重要的一種檢測(cè)手段。

2.3 PCR-ELISA技術(shù)

PCR-ELISA是在微孔板上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行的快速、非放射性檢測(cè)。應(yīng)用PCR法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，PCR-ELISA引入了探針，具有引物和探針雙重的特異性，并且具備了PCR技術(shù)靈敏、快速的特點(diǎn)。PCR-ELISA技術(shù)是在PCR基礎(chǔ)上結(jié)合了ELISA這種同樣具有高度敏感性的檢測(cè)手段，使生物信號(hào)在反應(yīng)過(guò)程中逐級(jí)放大。因?yàn)镻CR-ELISA技術(shù)是一個(gè)半定量的檢測(cè)技術(shù)，具有引物和探針的雙重特異性，并且酶標(biāo)儀讀數(shù)的客觀(guān)性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異性增強(qiáng)，靈敏度提高，避免了PCR檢測(cè)易出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)檢測(cè)設(shè)備只需普通PCR儀和酶聯(lián)免疫儀，設(shè)備價(jià)格低，可以在一般實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

2.4 免疫磁珠PCR技術(shù)

免疫磁珠是免疫學(xué)和磁載體技術(shù)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)新型材料。IMB是包被有單克隆抗體的磁性微球，可與含有相應(yīng)抗原的靶物質(zhì)特異性地結(jié)合形成新的復(fù)合物。在經(jīng)過(guò)短時(shí)間的前增菌后，用免疫磁珠法捕獲目的菌，在磁場(chǎng)的作用下與其他物質(zhì)分離，用捕獲的目的菌制備模板DNA，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯像進(jìn)行檢測(cè)，該法有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了傳統(tǒng)PCR法的檢出率，檢測(cè)設(shè)備只需用普通PCR儀，可以在一般實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

2.5 套式PCR技術(shù)

套式PCR，又稱(chēng)巢式PCR，是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱(chēng)為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部），結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片斷短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異，檢測(cè)設(shè)備只需普通PCR儀，可以在一般實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

食品中的致病菌檢測(cè)方法很多，主要有傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、PCR、免疫學(xué)方法等。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)程序繁瑣，至少需要幾天才能得出結(jié)論，難以適應(yīng)快速簡(jiǎn)便的要求。常規(guī)的PCR方法雖然符合快速簡(jiǎn)便等要求，但是它易污染，假陽(yáng)性高。相比之下，RT-PCR和熒光定量PCR克服了PCR的缺點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)儀器試劑價(jià)格昂貴，不利于一般實(shí)驗(yàn)室采用。PCR-ELISA技術(shù)、免疫磁珠PCR技術(shù)、套式PCR技術(shù)結(jié)果可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)儀器試劑價(jià)格相對(duì)較低，可在一般實(shí)驗(yàn)室采用，但操作相對(duì)復(fù)雜，不可定量檢測(cè)。操作者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇合適的快速檢測(cè)技術(shù)。

如何利用新技術(shù)、新手段盡量消除或減少由于人為因素引起的誤差，提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀(guān)性，同時(shí)達(dá)到良好的檢測(cè)效果，仍然是致病菌質(zhì)量控制工作中值得探討的問(wèn)題和嘗試的新方向。PCR檢測(cè)技術(shù)目前已經(jīng)在國(guó)際上獲得廣泛的認(rèn)可，在很大程度上可消除或減少生化鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)，許多步驟依靠操作者的主觀(guān)判斷等主觀(guān)因素造成誤差，并且具有節(jié)約時(shí)間、簡(jiǎn)化工作量的優(yōu)點(diǎn)，有益于在今后致病菌檢測(cè)中使用。

[1]劉華偉，郭藹光，馬立農(nóng)等．PCR技術(shù)在沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（6）：55-58．

[2]黃文宇，柳陳堅(jiān).食源性沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)，2009，19（3）：95-99.

[3]鐘偉軍，趙明秋，鄧中平．熒光定量PCR快速檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌方法的建立及初步應(yīng)用[J]．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30（3）：220-224．