總黃酮類化合物含量測(cè)定方法和藥理作用研究進(jìn)展

田永利 許志宇 葛林 劉娜

總黃酮類化合物是廣泛地存在于植物中的一類化合物，目前已有近萬(wàn)種總黃酮被鑒定，植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類低分子量天然物質(zhì)，在蔬菜、作物、水果等植物中均有分布，此類化合物具有具有保護(hù)心腦血管、利膽保肝、清除自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗過(guò)敏、抗炎癥、抗病毒等多種生物活性及藥理作用。不少總黃酮化合物同時(shí)還存在多種功效。

1 總黃酮含量測(cè)定

中藥成分復(fù)雜，總黃酮化合物生物活性及藥理作用顯著，種類繁多，為了明確哪類中藥總黃酮含量較高，總黃酮含量測(cè)定成為重要方法。選擇適當(dāng)檢測(cè)方法測(cè)量總黃酮含量，有利于提高藥物分析準(zhǔn)確性。

1.1 紫外可見(jiàn)分光光度法 嚴(yán)贊開(kāi)［1］綜述了紫外分光光度法測(cè)定植物中黃酮含量的方法.重點(diǎn)介紹了單波長(zhǎng)法、差示法、雙波長(zhǎng)法、三波長(zhǎng)法、導(dǎo)數(shù)法等紫外分光光度法測(cè)定黃酮類化合物含量的原理及分析特性。

1.1.1 紫外可見(jiàn)分光光度法:是以分子吸收光譜為基礎(chǔ)的紫外－可見(jiàn)分光光度法，利用某些物質(zhì)的分子在峰帶I(300～400 nm)和峰帶Ⅱ(220～280 nm)光譜區(qū)的吸光度來(lái)進(jìn)行分析測(cè)定的方法。具有簡(jiǎn)便、適用性廣、準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性較好等特點(diǎn)，在總黃酮含量分析中發(fā)揮著重要作用。

1.1.2 比色法:是一些藥典最常用的總黃酮含量檢測(cè)方法，它主要以Al(NO3)3為顯色劑，在堿性條件下，利用其與總黃酮形成紅色螯合物為特征。常用于總黃酮類化合物含量測(cè)定的金屬鹽試劑有Al(NO3)3、AlCl3等。

1.1.3 差示分光光度法簡(jiǎn)稱ΔA法:使用稍高于樣品或稍低于樣品的標(biāo)準(zhǔn)作參比，測(cè)量樣品和參比間的相對(duì)吸光度。而此相對(duì)吸光度又與樣品和參比間的濃度差成比例關(guān)系，借差示工作曲線而求出樣品的含量。

1.1.4 雙波長(zhǎng)和導(dǎo)數(shù)分光光度法:用于測(cè)定吸收光譜曲線重達(dá)的混合物的含量而不須用解聯(lián)立方程，還可分析高濃度及混濁樣品，其靈敏度和準(zhǔn)確度比普通分光光度法好。在選擇波長(zhǎng)時(shí)，原則上除了要干擾物有相等吸光度外，還要求兩波長(zhǎng)比較接近，被測(cè)組分在該兩波長(zhǎng)處的摩爾吸收系數(shù)相差大些，這樣方法的靈敏度會(huì)更高。如果將上述雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)上兩個(gè)波長(zhǎng)盡可能指近，使只相差1～2 nm，并且同時(shí)進(jìn)行掃瞄，能得到試樣一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜-吸光度對(duì)波長(zhǎng)的變化率曲線，即導(dǎo)數(shù)分光光度法。

1.2 色譜測(cè)定方法 陳叢瑾等［2］綜述了黃酮類化合物含量的色譜測(cè)定方法，包括薄層掃描法、高效液相色譜、超臨界流體色譜等，旨在為黃酮類化合物的研究、開(kāi)發(fā)、應(yīng)用提供參考。

1.2.1 薄層掃描法(TLCS):亦稱薄層光密度法(TLC-Densitometry)，是薄層色譜技術(shù)與光密度計(jì)和微型電子計(jì)算機(jī)結(jié)合起來(lái)的一種新型儀器分析方法。樣品經(jīng)薄層分離后直接測(cè)定或經(jīng)適當(dāng)處理后使之顯色或產(chǎn)生熒光，在特定波長(zhǎng)下用光度計(jì)測(cè)定其吸光度或熒光強(qiáng)度的方法。具有快速、簡(jiǎn)便、專屬性好。同時(shí)可測(cè)定多個(gè)樣品的特點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用在中藥及其制劑的研究中，進(jìn)行中藥的成分研究和含量測(cè)定。

1.2.2 高效液相色譜法(HPLC):是在液相色譜的基礎(chǔ)上引入氣相色譜的理論和技術(shù)，并加以改進(jìn)而發(fā)展起來(lái)的一種重要的分離分析方法。具有分離效能高，分析速度快，靈敏度高等特點(diǎn)。電化學(xué)檢測(cè)器提高了高效液相的檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，而且可以連續(xù)檢測(cè)中藥中的多種總黃酮成分。

1.2.3 超臨界流體色譜法 (supercritical fluid chromatography，SFC法):近年來(lái)出現(xiàn)的一種新方法，在分析領(lǐng)域得到應(yīng)用，該法在國(guó)際上發(fā)展很快，但在我國(guó)還處于探索階段。

1.3 毛細(xì)管電泳法 是以電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)離子或荷電粒子，在毛細(xì)管中按其淌度或分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速的電泳分離新技術(shù)。常用的方法主要有毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、膠束電動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管色譜(MEKC)、毛細(xì)管凝膠電(CGE)、毛細(xì)管等速電泳(CITP)等。操作模式中特別是CZE和MEKC都能很好的用于中藥成分含量分析。具有柱效高、分離速率快、樣品用量少，適用于“臟樣品”分析等特點(diǎn)。

1.4 熒光分光光度法 利用黃酮類化合物與某些金屬離子的絡(luò)合物在紫外線照射下可產(chǎn)生熒光，在一定條件下，熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度成正比的性質(zhì)可建立黃酮類化合物的熒光光度法?？傸S酮化合物的熒光光度測(cè)定法尚不多見(jiàn)，桑色素用于鈹?shù)臒晒夤舛葴y(cè)定有很高靈敏度，常被用作黃酮類化合物熒光光度測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)［3］。隨著學(xué)科的深入發(fā)展，共振散射光譜法、單掃示波極譜法也逐漸應(yīng)用于總黃酮的含量測(cè)定。

2 藥理作用

2.1 鎮(zhèn)痛作用 趙鐵華等［4］研究結(jié)果顯示灌胃、腹腔注射、皮下注射適宜劑量的黃芩莖葉總黃酮，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)化學(xué)和熱刺激導(dǎo)致的疼痛反應(yīng)皆有一定的抑制作用，其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制與中樞作用相關(guān)。銀杏總黃酮(TFG)腹腔內(nèi)注射可顯著抑制甲醛致小鼠疼痛反應(yīng)，延長(zhǎng)小鼠舔足潛伏期并減少小鼠扭體反應(yīng)數(shù)。

2.2 對(duì)心血管系統(tǒng)的作用

2.2.1 對(duì)抗心肌損傷的保護(hù)作用:李樂(lè)等［5］研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)總黃酮能減輕犬心肌梗死時(shí)的心肌缺血程度，降低缺血范圍和心肌酶學(xué)指標(biāo)的活性，可保護(hù)缺血心肌。廣棗總黃酮(TFCA)對(duì)阿霉素(ADR)引起大鼠心肌過(guò)氧化損傷具有保護(hù)作用。水杉總黃酮可在不明顯降低血壓的情況下，防止腎性高血壓大鼠左心室肥厚的發(fā)生。銀杏葉總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注血管內(nèi)皮損傷有保護(hù)作用，對(duì)抗心肌缺血所引起的心肌電生理的變化，從而預(yù)防心肌缺血所致的心律失常的發(fā)生。蒲黃總黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血犬心肌具有保護(hù)作用［6］。黃蜀葵花總黃酮藥理性預(yù)適應(yīng)可通過(guò)抑制心肌脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制心肌炎癥反應(yīng)，對(duì)缺血;再灌注損傷的心肌具有保護(hù)作用;顯著降低心腦組織中丙二醛和NO含量，提示黃蜀葵花總黃酮對(duì)心腦缺氧有顯著保護(hù)作用;對(duì)小鼠急性心肌缺血、缺氧損傷具有保護(hù)作用［7］。

2.2.2 抗心率失常作用:苦參總黃酮能明顯對(duì)抗烏頭堿、哇巴因及氯仿誘發(fā)的心率失常。黃芩莖葉總黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性心率失常有顯著拮抗作用。

2.2.3 降血脂:銀杏葉總黃酮具有降低甘油三酯和膽固醇，升高高密度脂蛋白膽固醇和降低低密度膽固醇的作用?？箘?dòng)脈粥樣硬化作用實(shí)驗(yàn)顯示麥胚總黃酮類提取物(FEWG)能顯著提高實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血高密度脂蛋白膽固醇含量，同時(shí)顯著降低血清總膽固醇和三酰甘油含量［6］。蕎麥種子總黃酮能抑制喂飼固醇和高脂食物大鼠血清總膽固醇和三酰甘油的升高，抑制肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化。山楂總黃酮對(duì)氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有顯著的拮抗作用，對(duì)氧化型低密度脂蛋白促M(fèi)C-EC黏附作用有顯著的抑制性，降低動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的危險(xiǎn)性，起到預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用。

2.2.4 抗高血壓、血管壁擴(kuò)張作用:銀杏葉總黃酮其對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性具有明顯的抑制作用。并對(duì)輕、中、重度妊娠高血壓患者的血壓均有下降，內(nèi)皮素活性及NO含量降低，尿蛋白減少［8］。淫羊藿總黃酮對(duì)大鼠血清中內(nèi)皮素有抑制作用，一氧化碳含量明顯降低，提示淫羊藿總黃酮擴(kuò)張血管。

2.3 抗凝血作用 銀杏黃酮、蚓激素酶均具有很好的抗凝作用，但凝激酶溶栓效果優(yōu)于銀杏黃酮，兩者合用后溶血作用無(wú)加強(qiáng)，但具有較好的抗凝效果［9］。水杉總黃酮有抗血小板聚集活性，改善血液流變性的作用，穿心蓮黃酮可明顯抑制二磷酸腺苷，花生四烯酸和腎上腺素誘導(dǎo)的血小板聚集，明顯降低凝血酶誘導(dǎo)的GMP-140水平，抑制AA誘導(dǎo)的血小板TXB2的釋放，并可明顯升高血小板內(nèi)cAMP的含量。

2.4 利膽及肝臟保護(hù)作用 各種黃酮類化合物對(duì)化學(xué)性肝損傷、藥物性肝損傷、免疫性肝損傷、酒精性肝損傷、缺血/再灌注性肝損傷等實(shí)驗(yàn)性肝損傷均有不同程度的保護(hù)作用［10］。知母總黃酮對(duì)溴酸鉀誘發(fā)的小鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用，可以明顯降低因溴酸鉀引起的小鼠血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平，保護(hù)因溴酸鉀誘發(fā)的肝損傷其作用機(jī)制可能部分來(lái)自于清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程［11］。苦菜總黃酮對(duì)四氯化碳、乙醇所致肝損傷有明顯保護(hù)作用，提示可能與苦菜總黃酮減少肝臟谷胱甘肽耗竭，抑制肝脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)。

2.5 抗氧化、清除氧自由基作用 黃欣等［12］研究發(fā)現(xiàn)枸杞總黃酮能明顯延長(zhǎng)小鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)時(shí)間，抑制丙二醛的產(chǎn)生及提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性，說(shuō)明枸杞總黃酮具有提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐力及清除活性氧的作用?？嗍w麥麩皮類黃酮與天然超氧化物歧化酶在清除氧自由基方面有著相同的作用一枝蒿總黃酮對(duì)的作用表現(xiàn)高濃度清除，低濃度增強(qiáng)的雙向作用;對(duì)(·OH)自由基的作用始終表現(xiàn)為濃度依賴性地清除作用，而且清除作用很強(qiáng)［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)竹葉的總黃酮含量及其清除活性氧自由基的能力均與銀杏葉具有可比性。黃芪總黃酮在實(shí)驗(yàn)中對(duì)(·OH)及(O2)均有較強(qiáng)的清除作用，且清除能力與濃度呈明顯的顯效關(guān)系。

2.6 抗腫瘤作用 黃酮類化合物抗腫瘤作用的靶點(diǎn)包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、硫氧還蛋白還原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、絲裂原激活的蛋白激酶等。腫瘤細(xì)胞凋亡研究依據(jù):(1)黃酮類化合物抑制細(xì)胞增殖，主要是使細(xì)胞周期停止，對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性和致突變作用，反而有抗氧化和正向的免疫調(diào)節(jié)作用;(2)黃酮類化合物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;(3)黃酮類化合物能抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇3激酶活性;(4)黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化壓力和促進(jìn)抑癌基因表達(dá)而抑制癌基因表達(dá)的作用。漢黃芩素是從中藥黃芩中提取分離得到的一個(gè)化合物，研究表明其能促進(jìn)鬼臼毒甙誘導(dǎo)的HL260、Jurkat和肺癌細(xì)胞的凋亡。芫花根總黃酮對(duì)小鼠S180腫瘤生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，其抗腫瘤活性是通過(guò)選擇性殺死腫瘤細(xì)胞和提高外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和提高NK細(xì)胞的殺傷活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的［14］。木犀草素具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡活性。

2.7 對(duì)腦血管疾病的作用 李曉紅等［15］銀杏葉總黃酮對(duì)局部缺血再灌注腦組織中NR1mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，銀杏葉制劑可以明顯抑制NR1mRNA的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡。文繼月等［16］黃蜀葵花總黃酮預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有缺血預(yù)適應(yīng)樣的保護(hù)作用;其機(jī)制可能與促進(jìn)NO合成及抑制前列腺素E2產(chǎn)生有關(guān)。山楂葉總黃酮可抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制線粒體細(xì)胞色素C通路的凋亡有關(guān)［8］。

2.8 其他

2.8.1 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用:黃酮對(duì)M-膽堿能抑制樟柳堿所致小鼠腦記憶獲得障礙、蛋白生物合成抑制劑環(huán)己酰亞胺致小鼠腦記憶鞏固障礙、中樞抑制劑乙醇致小鼠腦記憶再現(xiàn)障礙、小鼠腦缺血再灌注致學(xué)習(xí)記憶功能障礙，均有明顯的改善作用，能顯著提高小鼠的近期記憶和長(zhǎng)期記憶功能。

2.8.2 延緩衰老作用:淫羊藿總黃酮對(duì)于皮質(zhì)酮大鼠T細(xì)胞過(guò)度凋亡均有明顯下調(diào)作用，并能對(duì)促凋亡及抗凋亡基因群進(jìn)行適度地調(diào)控。蜂膠黃酮既能明顯提高腦組織抗氧化酶的活性，又同時(shí)顯著降低腦組織NO含量，提示蜂膠黃酮可以抑制NO的細(xì)胞毒作用，達(dá)到延緩衰老之目的。

2.8.3 對(duì)骨科方面的作用:淫羊藿總黃酮具有促進(jìn)體外成骨細(xì)胞增殖及分化成熟的作用，還可提高去勢(shì)大鼠骨密度，對(duì)骨質(zhì)疏松起防治作用。杜仲總黃酮能直接促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖。野菊花總黃酮可恢復(fù)大鼠滑膜細(xì)胞具分泌功能細(xì)胞器形態(tài)，降低滑膜細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)的功能。

2.8.4 對(duì)免疫方面的作用:淫羊藿總黃酮對(duì)免疫功能低下小鼠有良好免疫促進(jìn)作用。黃芩莖葉總黃酮對(duì)小鼠的特異性和非特異性免疫功能皆有一定的影響。

2.8.5 改善腎功能作用:黃蜀葵花抑制腎內(nèi)髓ATP酶活性，從而減少腎小管對(duì)鈉的重吸收，發(fā)揮利鈉利水效應(yīng)。

2.8.6 抗乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)作用:黃蜀葵花總黃酮中提取的金絲桃苷在體內(nèi)外均有抗HBV的作用，且呈劑量依賴性。

2.8.7 修復(fù)口腔黏膜作用:黃蜀葵花中的多種黃酮類成分具有抑菌、鎮(zhèn)痛及抗炎消腫的作用，能治療口腔潰瘍，對(duì)疼痛也有較好的緩解作用。沙棘葉總黃酮對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，在相同時(shí)間內(nèi)，總黃酮提取液的濃度越大，抑菌率越大。同一濃度的沙棘葉總黃酮的作用時(shí)間越長(zhǎng)，其抑菌率也越大［17］。

1 嚴(yán)贊開(kāi).紫外分光光度法測(cè)定植物黃酮含量的方法.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28:164-165.

2 陳叢瑾，黃克瀛，韋龍賓.色譜方法在植物黃酮含量測(cè)定中的應(yīng)用.光譜實(shí)驗(yàn)室，2007，24:821-824.

3 馬陶陶，張群林，李俊.中藥總黃酮的含量測(cè)定方法.安徽醫(yī)藥，2007，11:1030-1032.

4 趙鐵華，鄧淑華，石艷華，等.黃芩莖葉總黃酮鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2001，12:23.

5 李樂(lè)，孫曉東，高小利，等.絞股藍(lán)總黃酮對(duì)犬急性缺血心肌的保護(hù)作用.中國(guó)病理生理雜志，2008，24:388-389.

6 章紅燕，侯桂蘭，何福根.銀杏葉總黃酮和銀杏內(nèi)酯對(duì)心腦血管作用的研究進(jìn)展.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2008，10543.

7 范麗，袁麗萍，陳志武，等.黃蜀葵花總黃酮對(duì)小鼠急性心肌缺血缺氧損傷的保護(hù)作用.中國(guó)藥房，2005，16:176.

8 紀(jì)影實(shí)，曲極冰，李紅等.山楂葉總黃酮對(duì)大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，34:590-592.

9 陳健康，王雷，李珂，等.銀杏黃酮與蚓激酶的抗凝溶栓作用.心臟雜志，2001，13:3081.

10 郭菁菁，楊秀芬.黃酮類化合物對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性肝損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24:5-10.

11 李滿妹，江濤，黃杰昌.知母總黃酮對(duì)溴酸鉀誘發(fā)小鼠肝損傷的保護(hù)作用.中草藥，2008，39:252-253.

12 黃欣，趙海龍.枸杞總黃酮對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠腓腸肌抗氧化能力的影響.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17:2280-2281.

13 吳冰，徐貴發(fā)，趙秀蘭，等.麥胚黃酮提取物對(duì)荷瘤大鼠的抗氧化作用.衛(wèi)生研究，2001，30:2151.

14 魏志文，高曉雯，鄭維發(fā).芫花根總黃酮抗腫瘤活性研究.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24:116-120.

15 李曉紅，張峰，趙明霞，等.銀杏葉制劑對(duì)大鼠腦缺血再灌注后N-甲基-D-天冬氨酸受體表達(dá)的影響及腦保護(hù)作用.神經(jīng)科學(xué)通報(bào)，2005，21:210-213.

16 文繼月，陳志武.黃蜀葵花總黃酮預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注性損傷的保護(hù)作用.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41:667.

17 張益娜，翁琴.沙棘葉總黃酮的抑菌性研究.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008，25:25-27.