張祥勝，向廷生

(1.山東大學 微生物技術國家重點實驗室,山東 濟南 250100；2.長江大學 地球化學系,湖北 荊州 434023)

1 生物表面活性劑的相關概念

目前大多數(shù)市售的表面活性劑主要是來自石油基的化學產(chǎn)品，其生產(chǎn)過程需要消耗大量的石油產(chǎn)品，易污染環(huán)境，而且受到原材料、價格和產(chǎn)品性能等因素的影響，在生產(chǎn)和使用過程中常常會帶來嚴重的環(huán)境污染問題以及對人體的毒害問題。而生物表面活性劑則不存在這樣的問題，因而日益受到國內(nèi)外研究者的關注，成為近年來的研究熱點。

生物表面活性劑是由微生物在一定條件下產(chǎn)生的同時具有親水性和疏水性兩種結構的代謝產(chǎn)物，按分子量大小，可分為低分子和高分子兩類生物表面活性劑。低分子生物表面活性劑能有效降低表面或界面張力，其中以枯草芽孢桿菌的surfactin最為有名[1]；高分子生物表面活性劑主要功能不在于降低界面張力，而是分布在油滴的表面，對油/水界面表現(xiàn)出很強的親和力，從而有效地阻止它們的聚并，可使乳狀液得以穩(wěn)定，因此又稱生物乳化劑。研究最早也最為詳細的高分子生物表面活性劑是來自醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)RAG-1的Emulsan[2,3]。本文中所指表面活性劑主要指前一種。

同一般化學合成的表面活性劑一樣，生物表面活性劑具有以下特點：具有顯著降低表面張力、較低的臨界膠束濃度，對溫度、pH和鹽度不敏感，還具有專一性強，低毒性、可生物降解、環(huán)境友好、可利用廉價農(nóng)副產(chǎn)品生物發(fā)酵生產(chǎn)等優(yōu)點，某些生物表面活性劑還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用及生理活性。生物表面活性劑已在石油[4,5]、食品、化妝品及藥學等領域獲得廣泛的應用[6]。另外，在疏水性污染物(石油、有機氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴等)污染土壤的生物修復中也發(fā)揮了巨大作用[7,8]。

2 物理誘變因子種類及其在表面活性劑產(chǎn)生菌改良中的應用情況

提高代謝物的產(chǎn)量一般通過兩種方法，即優(yōu)化菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和通過各種技術手段來提高菌株的產(chǎn)量與活性。使用誘變或重組高產(chǎn)菌來提高產(chǎn)量還處于研究的初級階段，其中誘變由于使用經(jīng)濟方便，因而成為獲得生物表面活性劑高產(chǎn)菌的一種重要方法[9]，尤其是物理因子法以其安全、設備簡單、操作方便、價格低廉、誘變率高等優(yōu)點而受到人們的特別關注[10]。

微生物誘變育種常用的物理因素主要是各類輻射，其實質是造成不致死但修復錯誤的損傷，引起輻照細胞內(nèi)的遺傳物質(主要是DNA)發(fā)生點突變或染色體畸變，從而有可能提高產(chǎn)量[11]，具體過程主要包括物理階段、物理化學階段、化學階段以及生物學效應4個階段。

物理因素包括紫外線(非電離輻射)和電離輻射。而低能離子束作為一種較新穎的誘變源，雖然也是電離輻射，但由于其獨特性，單獨加以介紹。在國外，各種輻射主要用于放射生物學或癌癥放療的研究，故生物表面活性劑產(chǎn)生菌的物理誘變的資料較少。本文主要介紹國內(nèi)的研究進展情況。

2.1 紫外線

紫外線照射波長范圍為10-380nm，其引起生物體的主要損傷是相鄰堿基形成二聚體，阻礙堿基的正常配對而導致堿基置換突變[12]，用紫外線輻射產(chǎn)表活微生物以獲得高產(chǎn)菌株的文獻報道較多。

宋紹富等對高效驅油菌I進行紫外誘變，培育出代謝性能較好的菌株，發(fā)酵液的界面張力可由6.49 mN/m降低到5.86 mN/m，降低了9.7 %[13]。Mulligan等對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株ATCC 21332進行紫外誘變，將原菌株培養(yǎng)到對數(shù)期并轉移大約300個細菌到營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用短波紫外燈輻射大約35 s，得到產(chǎn)量提高3-4倍多的突變株[14]。

2.2 電離輻射誘變

電離輻射主要用的是γ射線和X射線。Raza[14]對惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida 33)進行γ射線誘變，得到突變株300-B，使用不同的疏水性碳源(烴類、植物油提煉廠廢物等)對該突變株進行發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)鼠李糖脂，得到最大生物量3.5 g·L-1、最大鼠李糖脂產(chǎn)量為4.1 g·L-1。Iqbal 等對銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa) S8進行γ射線誘變，得到以烴為碳源的高產(chǎn)表活突變菌EBN-8。突變體用原油烴為碳源的無機鹽培養(yǎng)基時表現(xiàn)出比出發(fā)菌株高3-4倍的烴乳化和轉化能力，在以十七烷為碳源時也表現(xiàn)出較高的表活產(chǎn)率(以乳化指數(shù)和無細胞發(fā)酵液的表面張力為指數(shù))，同時生長速率增加了2-3倍[15]。

2.3 低能離子束誘變

在產(chǎn)表面活性劑菌種改良方面，中國科學院離子束生物工程學重點實驗室走在前列。劉清梅用低能離子束誘變改良產(chǎn)脂肽枯草芽孢桿菌，應用參數(shù)為能量20 keV、劑量2.6×1015N+/cm2，經(jīng)過多輪誘變得到一株表面活性大為提高的突變菌株E-8。該菌株Landy培養(yǎng)基的去細胞發(fā)酵液稀釋50倍和100倍后，其表面張力值為27.1 mN/m和28.5 mN/m，分別比出發(fā)菌同等條件下表面活性提高4.6倍和16.4倍。而該菌株的生長特性和表面活性物質的產(chǎn)生特性與出發(fā)菌株相比，變化不明顯[16]。在此基礎上，對培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，并成功轉化為產(chǎn)品[6]，商品名為莎梵婷，獲得了可觀的經(jīng)濟和社會效益。同時用低能離子輻照勝利油田油層中分離得到的一株細菌Sp-5-3，最終得到一株產(chǎn)物乳化性能大為提高的突變菌株S-34[17]。但除此之外，幾乎沒有報道，最新相關綜述文章認為離子束誘變技術在獲得生物表面活性劑高產(chǎn)菌上還沒有應用，并且還認為離子束誘變獲得的突變菌株回復突變率較高[9]。但依筆者的體會和其他研究者的文獻報道，顯然這是不科學的觀點。這也說明，由于離子束生物工程學裝置造價較高(目前市場價約100萬元/臺)，應用相對較少[18]，國內(nèi)生物表面活性劑研究者多數(shù)還沒有認識到離子束誘變技術的作用。離子束誘變技術仍是獲得生物表面活性劑高產(chǎn)菌有潛力的手段之一。

2.4 其他物理誘變技術

霍丹群等用自主研制的基于梳狀交叉微電極陣列結構的細胞電操作系統(tǒng)，開展產(chǎn)表面活性劑BS-37菌株選育研究，獲得一株高產(chǎn)菌，其表面張力從51.47 mN/m降低至37.59 mN/m，乳化力從62 %升高至85 %[19]。另外，以下幾種新型的誘變技術值得注意，但目前應用于產(chǎn)表活微生物的研究未見報道。

一是空間誘變育種。又稱航天育種或太空育種，是指利用返回式衛(wèi)星、飛船或高空氣球將生物材料搭載到太空，利用太空特殊的環(huán)境(空間宇宙射線、微重力、高真空、弱磁場等因素)對生物材料進行誘變，再返回地面選育新種質、新材料，培育新品種的生物育種新技術。這些空間條件都有可能引起微生物發(fā)生遺傳性變異?？臻g突變的最大特點是突變頻率高、突變譜廣、變異幅度大、變異性狀穩(wěn)定快從而使育種周期縮短、生物安全性提高[20,21]。

二是微波輻射。屬于一種低能電磁輻射，具有較強生物效應的頻率范圍在300 MHz-300 GHz，對生物體具有熱效應和非熱效應。在這兩種效應的綜合作用下，生物體會產(chǎn)生一系列突變效應。 目前主要應用于曲霉、沙門氏菌、酵母[22]、孢霉屬真菌[23]等。如，在白僵真菌的誘變效果上，微波略優(yōu)于紫外線，而且操作更簡單[24]。

三是激光。為一種量子流。激光作用于生物組織后產(chǎn)生熱、壓力、光化和電磁場等的現(xiàn)象，起主要作用的是光效應和電磁場效應，引起細胞染色體畸變效應、酶的激活或鈍化，以及細胞分裂和細胞代謝活動的改變[25]。激光誘變技術具有操作簡單、安全、變異率高、輻射損傷輕等優(yōu)點，在微生物育種實踐中取得了一定成果。激光可應用于微生物誘變育種和介導轉基因，具有較大的潛力[26]。目前湖南師范大學激光輻射生物實驗室的研究較為領先。

在利用單一物理因子作用于微生物的同時，開始嘗試用多種物理因子組合作用微生物。但在產(chǎn)表活菌的改良上用的不多。常見的組合是屬非電離輻射的紫外與屬電離輻射的離子束、γ射線的組合。

2.5 物理誘變因子和其他誘變技術手段的復合

劉七[27]等以自行分離的兼性厭氧菌I為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外和甲基磺酸乙酷復合誘變，得到1株性能優(yōu)良的變異新菌株，可將界面張力從6.49 mN/m降低到4.36 mN/m，降低了32.8 %。沈薇等以產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑的銅綠假單胞菌BS-03為出發(fā)菌株，對其進行UV和UV+LiCl的誘變，篩選得到1株產(chǎn)量提高了1.658倍(由4.1 g·L-1提高到6.89 g·L-1)的菌株LY4[28]。

3 物理誘變產(chǎn)表活微生物要注意的幾個問題

物理因子的生物效應研究是生命科學的重要內(nèi)容，也是物理學與生物學自身發(fā)展、相互滲透、分支交融的必然結果。物理因子誘變微生物的研究與應用具有極其重要的實踐意義[10]。下面就以下幾個問題展開討論。

3.1 綜合運用多種技術

傳統(tǒng)的誘變育種技術中存在的突變不定向、效率低、性質不穩(wěn)定、有益突變率低、易發(fā)生回復突變等缺點[9]，尤其是即使是一些新型的物理誘變技術，如離子束、低溫等離子體、激光、微波和空間誘變技術等，也是不定向的。因此，綜合運用物理誘變技術(主要是非電離輻射誘變與電離輻射誘變相結合)或將物理誘變技術與化學誘變技術、基因工程技術等相結合，努力提高誘變效率、獲得穩(wěn)定的突變體等，是大有可為的。尤其是根據(jù)菌種改良技術的進步和實際需要，發(fā)展定向物理誘變技術，是目前的努力方向之一。

自身產(chǎn)物的誘變技術也有報道。例如秦新政等對鼠李糖脂生產(chǎn)菌種假單胞菌進行高濃度的鼠李糖脂處理，獲得了產(chǎn)量提高50 %以上的突變株[29]。Carrera Paolo等人專利報道培育成一株耐反饋抑制的枯草芽孢桿菌菌株ATCC55033，在反應器中加入其自身合成的脂肽時，對自身生長影響有限，對脂肽的合成也無抑制作用，由此脂肽產(chǎn)量提高了1倍[30]。今后在進行物理誘變時，也可以借鑒這一研究思路，即在高濃度的產(chǎn)物添加到篩選平板和搖瓶中，期望得到抗反饋抑制或阻遏的突變株。

3.2 確定合適的評價和篩選方法

測定生物表面活性劑產(chǎn)生的方法有：液滴坍塌法[31,32]、排油圈法和血平板裂解法[33]。血平板法的缺點是，如果血平板制作不好則不易發(fā)現(xiàn)溶血圈，直接影響到實驗結果的觀察，也不能用于需要烴類物質才產(chǎn)生表面活性劑的微生物的篩選，而且溶血活性也可能與微生物存在溶血酶有關，而不是因為微生物產(chǎn)生了生物表面活性劑。96孔板液滴坍塌法，被國外研究者認為是一種高通量分析技術[31]，且精度較高，但操作繁瑣，且不適宜檢測低劑量表面活性[32,34]。排油圈法是較為常用的一種方法。表面活性劑濃度與排油圈直徑和培養(yǎng)液表面張力之間都呈線性關系，通過它們之間的線性圖，根據(jù)其中的一個參數(shù)就能計算出另外兩個參數(shù)[35]。如果能用血平板篩選的，盡量用血平板篩選，畢竟平板篩選還是便捷高效的方法，大分子乳化劑往往不能產(chǎn)生溶血圈，或是以烴為碳源的產(chǎn)表活菌也不能用血平板篩選，可以考慮用油平板[36]或藍色凝膠平板篩選[37]，也可以改進配方，比如用發(fā)酵培養(yǎng)基做基本培養(yǎng)基，再加CTAB和亞甲基藍。如不能用平板進行篩選，則可以采用發(fā)酵后測定發(fā)酵液無細胞上清的排油圈的方法進行篩選，取排油圈較大的測表面張力，結合測定發(fā)酵液的乳化能力，并最終以粗提物產(chǎn)量為復篩的指標。

在高產(chǎn)育種實踐中，為了提高篩選效果，在平板初篩時，可采用小瓊脂塊大通量篩選法。小瓊脂塊大通量篩選法是日本學者八木建立，后用于春雷霉素選育，篩選效果良好[38]。但這種方法要求菌落及產(chǎn)物擴散性好，故更適于放線菌和絲狀真菌的抗生素產(chǎn)量性狀的篩選，實際上目前大多數(shù)文獻處理材料都是這兩類微生物[39,40]。筆者曾嘗試采用該法篩選產(chǎn)糖脂的假單胞菌高產(chǎn)菌株，實際操作中遇到一些問題，如瓊脂塊易干燥，采取保濕措施則易污染，細菌菌落擴散很慢，達不到瓊脂塊的邊緣，瓊脂塊與篩選平板結合的緊密程度影響糖脂在篩選平板中的擴散，即使是同一個菌株，透明圈直徑差異也較大等，但相信采取適當?shù)拇胧朔щy，即可使這一高通量篩選方法在產(chǎn)表活高產(chǎn)菌篩選中獲得應用。

3.3 既要重視產(chǎn)量，也要重視品質。

目前中國在開發(fā)和改良產(chǎn)表活微生物方面仍與國外有較大差距，如國外已經(jīng)將糖脂或脂肽產(chǎn)量提高到50 g·L-1的水平[30]，在產(chǎn)量方面仍需努力，但品質方面仍要重視。研究和應用最廣泛的是糖脂，其中又以銅綠假單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂為主[29]，脂肽類表面活性劑研究得不太多。同是10 g·L-1的產(chǎn)量，糖脂和脂肽的功性顯然是不同的，或是誘變后的產(chǎn)量雖然有了大幅度提高，但如果品質下降或性能下降，顯然也沒有達到預期目的。當然，也有研究者已經(jīng)認識到這方面的問題。Noha H.Youssef等為了研究207個產(chǎn)表活菌株分別進行好氧和厭氧培養(yǎng)后提取表面活性劑發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌類主要產(chǎn)脂肽類表面活性劑，其表面活性與結構存在重要相關，尤其是脂肽的脂肪酸的含量[41]。國內(nèi)采用離子誘變獲得的突變菌株的分子量1 022 Da的環(huán)脂肽類表面活性物質比國內(nèi)外研發(fā)的1 036 Da環(huán)脂肽少一個亞甲基(-CH2)，其表面活性更強，CMC 值僅為1 μM，在濃度低至20 μM 就可將水的表面張力從72 mN/m降低到27 mN/m，是有文獻記載的最強的生物表面活性劑[3,16]。

目前，生物表面活性劑只有少數(shù)產(chǎn)品走向市場，大多數(shù)品種還都處于實驗研究階段，還沒有進行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，這主要是由于生產(chǎn)成本較高。而決定生物表面活性劑生產(chǎn)成本的主要因素有菌株、原料、發(fā)酵工藝和下游技術等，其中菌株是重中之重。只有不斷改進物理因素誘變手段在內(nèi)的菌株改良技術，不斷培育可低成本發(fā)酵、品質優(yōu)良、抗逆性好的高產(chǎn)菌株，才能大幅度提高生物表面活性劑與化學表面活性劑的性價比，為生物表面活性劑的推廣奠定良好基礎。而物理因素的誘變技術由于成本低、起點低、易在基層單位和企業(yè)推廣等優(yōu)點，即使在基因工程技術大發(fā)展的今天，仍有旺盛的生命力和應用價值，尤其是新型物理因素的誘變技術，更是值得大力推廣。目前作者所在的石油地質微生物技術課題組，應用離子束在內(nèi)的誘變源，對自有的石油微生物進行誘變改良，取得了良好的效果，可望在不久即獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，并在盡快在油田及化工等企業(yè)推廣應用。

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