系統(tǒng)生物學和合成生物學研究在生物燃料生產(chǎn)菌株改造中的應用

趙心清，白鳳武，李寅

1 大連理工大學生命科學與技術學院，大連 116024 2 中國科學院微生物研究所，北京 100101

系統(tǒng)生物學和合成生物學研究在生物燃料生產(chǎn)菌株改造中的應用

趙心清1，白鳳武1，李寅2

1 大連理工大學生命科學與技術學院，大連 116024 2 中國科學院微生物研究所，北京 100101

基于生物質資源生產(chǎn)環(huán)境友好的生物燃料，對經(jīng)濟和社會的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，但其生產(chǎn)成本高的問題十分突出，而高效生產(chǎn)菌株的獲得是解決這一問題的根本出路。以下綜述了利用系統(tǒng)生物學研究所獲得的信息進行菌種改造的過程，重點論述了生產(chǎn)菌株脅迫耐受性方面的研究進展，并討論了系統(tǒng)生物學、合成生物學和代謝工程技術在改造生物燃料生產(chǎn)菌株中的應用，展望了合成生物學在構建高效生物能源生產(chǎn)菌株方面應用的前景。

系統(tǒng)生物學，合成生物學，代謝工程，生物燃料，菌株改造

Abstract:Biofuels are renewable and environmentally friendly, but high production cost makes them economically not competitive, and the development of robust strains is thus one of the prerequisites.In this article, strain improvement studies based on the information from systems biology studies are reviewed, with a focus on their applications on stress tolerance improvement.Furthermore, the contribution of systems biology, synthetic biology and metabolic engineering in strain development for biofuel production is discussed, with an expectation for developing more robust strains for biofuel production.

Keywords:systems biology, synthetic biology, metabolic engineering, biofuels, strain improvement

⑩Louis D．Brandeis，Other People’s Money and How The Bankers Use IT，Martino Publishing，1988，p．92．

與石油基液體燃料相比，生物燃料不僅生產(chǎn)原料是可再生的生物質資源，而且燃燒產(chǎn)生的 CO2可以被植物光合作用吸收，可顯著降低溫室氣體的凈排量，對經(jīng)濟和社會的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義，因此得到了國內外學者和政府的高度重視。然而，目前生物燃料生產(chǎn)成本過高的問題仍然十分突出，以燃料乙醇為例，在美國燃料乙醇生產(chǎn)主要靠政府的稅收優(yōu)惠政策，而我國的燃料乙醇生產(chǎn)則依賴國家直接財政補貼。

二是建立健全群眾監(jiān)督機制。深入推進黨務公開工作，健全和完善黨內外情況反映制度、征求意見制度等，通過設立領導接待日、設置意見郵箱等，為群眾監(jiān)督提供便利的反映渠道。通過開展問卷調查、滿意度測評等方式，組織服務對象對機關黨組織和黨員的服務工作開展評價。利用互聯(lián)網(wǎng)技術和微博、微信、QQ、郵箱等溝通載體，逐步建立服務群眾網(wǎng)上平臺，提高監(jiān)督反饋的時效性。健全相應的工作保障機制,推動整改與反饋，使師生監(jiān)督產(chǎn)生實效。

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料的生產(chǎn)成本主要由原料成本和能耗成本構成。使用廉價易得的以農作物秸稈為代表的木質纖維素類生物質生產(chǎn)生物燃料，替代成本高而且潛在影響糧食安全的淀粉質原料，是降低生物燃料生產(chǎn)原料成本的根本出路，但纖維素類物質的生物轉化還存在效率低等諸多問題[1-2]。提高發(fā)酵終點產(chǎn)物濃度，節(jié)省后續(xù)分離的能耗及廢糟液量，進而節(jié)省廢糟液處理的能耗，以及提高發(fā)酵溫度，使發(fā)酵系統(tǒng)在夏季高溫季節(jié)可以使用循環(huán)冷卻水替代能耗高、設備投資大的低溫冷卻水，節(jié)省發(fā)酵系統(tǒng)運行能耗，是節(jié)省能耗的兩個主要方向。不論是拓寬發(fā)酵底物利用廉價的原料，還是提高發(fā)酵終點產(chǎn)物濃度和發(fā)酵溫度，都有賴于構建性能優(yōu)良的菌株。

近年來，利用系統(tǒng)生物學研究獲得的信息深入理解環(huán)境因素對細胞生理代謝的影響，并指導代謝工程操作，以及基于合成生物學理論，定向設計全新的代謝途徑，都取得了很大進展。本文綜述了這些研究在構建生物燃料高效生產(chǎn)菌株方面的進展，并展望了系統(tǒng)生物學和合成生物學研究在構建高效生物燃料生產(chǎn)菌株中的應用。

1 系統(tǒng)生物學與生物燃料生產(chǎn)菌種構建

1.1 系統(tǒng)生物學方法改造菌株與傳統(tǒng)方式的比較

傳統(tǒng)方法改造菌株往往通過菌種的多次隨機誘變和定向篩選，或者通過菌種的馴化獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，但存在的問題是改造過程隨機性很大，因此非常費時費力，而且對菌種性能提高的機制認識不足。隨著人們對代謝途徑和調節(jié)機制認識的深入，代謝工程技術得到了較快發(fā)展，通過過量表達或敲除代謝途徑關鍵酶基因，實現(xiàn)對代謝網(wǎng)絡的定向優(yōu)化[3]。如Ingram小組通過在大腸桿菌中過量表達運動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶PDC和乙醇脫氫酶ADH2，成功構建了工程菌種KO11，其乙醇發(fā)酵速率與釀酒酵母接近[4]。然而代謝工程操作對于多基因決定的性狀難以實現(xiàn)理想的效果，尤其是對于控制機制不是很清楚的代謝途徑，無法找到合適的基因靶點進行操作。反向代謝工程的發(fā)展通過對性能提高的突變體的代謝途徑進行分析，尋找提高菌株生理性能的關鍵靶點，從而實現(xiàn)代謝途徑的定向改造，也取得了一定成功[5]。近年來發(fā)展的基因組改組(Genome shuffling)[6]和全局轉錄工程機制工程(Global transcription machinery engineering，gTME)[7]為菌種改造提供了新的思路，即通過對菌株基因組規(guī)模的重組或者基因組規(guī)模的轉錄水平的控制獲得代謝網(wǎng)絡優(yōu)化的菌株，但以上這些操作仍然涉及到突變的不定向性和對大量突變體進行篩選。而且，由于細胞內部代謝網(wǎng)絡的相互作用和調節(jié)機制的存在，一些與代謝途徑表面上似乎沒有關系的基因，其表達水平或者表達產(chǎn)物也可能對代謝網(wǎng)絡的優(yōu)化具有重要的影響，同時，過量表達某一個基因或者某幾個基因可能引起代謝網(wǎng)絡整體平衡的失調，從而影響代謝工程的成功[8]。因此，如何尋找這些影響代謝途徑優(yōu)化的關鍵基因，并且達到對代謝網(wǎng)絡的平衡調控，是代謝工程操作的重要研究內容。

系統(tǒng)生物學的發(fā)展，已經(jīng)可以使人們從基因組規(guī)模去全面理解細胞的代謝網(wǎng)絡，包括組成代謝途徑的結構基因、細胞代謝復雜的調節(jié)機制，以及遺傳和環(huán)境擾動對細胞全局代謝的影響，從而建立組學規(guī)模的代謝模型，對可能的基因工程操作效果進行評價和預測，并通過對基因工程操作后獲得的菌株的代謝網(wǎng)絡分析，從而更好地指導代謝工程操作手段，改善細胞的生理功能和生產(chǎn)性狀[8]。系統(tǒng)生物學研究涉及到生物信息學、數(shù)學、分子生物學以及化學工程學等多學科的交叉和整合，使人們對復雜生命現(xiàn)象的了解更加全面和深入。利用系統(tǒng)生物學研究思想指導菌株改造的流程見圖1。

系統(tǒng)生物學發(fā)展的不同階段出現(xiàn)了不同的名詞，包括系統(tǒng)生物技術[9]、系統(tǒng)代謝工程[10]和最新提出的工業(yè)系統(tǒng)生物學[11]等。這些名詞代表了系統(tǒng)生物學研究不同階段的不同側重點，現(xiàn)分別討論如下：

隨著我國社會及經(jīng)濟的不斷發(fā)展，商品外包裝已經(jīng)不再是單純的包裝作用，還應能通過商品外包裝體現(xiàn)出商品自身的文化特質、質量特點等，進而確保這些商品能更好的在市場上占據(jù)一席之地。陶瓷在現(xiàn)代酒類包裝設計中的應用將能更好的提升商品包裝的價值。使用陶瓷作為酒類產(chǎn)品包裝容器，消費者不需要將商品包裝作為廢品進行處理，陶瓷器具本身具備非常高的藝術欣賞價值。結合這些內容來說，除了提升商品質量之外，保證商品外包裝的價值和品質也是非常重要的，因此，在現(xiàn)代酒類包裝設計過程中，相關設計人員應能將陶瓷器具及陶瓷元素等靈活的應用起來。

系統(tǒng)生物技術(Systems biotechnology)[9]：利用系統(tǒng)生物學的高通量組學數(shù)據(jù)建立代謝模型，設計具有優(yōu)化的代謝能力的細胞，強調各種組學工具在生物技術領域的應用，以及借助組學工具，在對細胞在不同遺傳和環(huán)境條件擾動下的整體代謝水平變化理解的基礎上進行代謝模型的構建和修飾。

[3]Na D, Kim TY, Lee SY.Construction and optimization of synthetic pathways in metabolic engineering.Curr Opin Microbiol, 2010, 13: 363?370.

工業(yè)系統(tǒng)生物學(Industrial systems biology)[11]：利用系統(tǒng)生物學研究手段建立可預測的基因組規(guī)模代謝模型，并提出有效的改造策略，提高基因組信息已知的工業(yè)生產(chǎn)宿主的生產(chǎn)能力和生產(chǎn)效率，提高工業(yè)生物技術產(chǎn)品的經(jīng)濟性和可持續(xù)性發(fā)展能力。強調系統(tǒng)生物學在生產(chǎn)工業(yè)生物技術產(chǎn)品中的應用，注重組學數(shù)據(jù)的整合，以提高代謝模型的可預測性，并進行代謝工程操作的有效性開發(fā)。

可以看出，隨著系統(tǒng)生物學的發(fā)展，系統(tǒng)生物學工具在工業(yè)生產(chǎn)宿主選育中的應用也從最初的單一組學研究，到多種組學工具的聯(lián)合使用和數(shù)據(jù)整合；從定性研究生物系統(tǒng)，到對生物系統(tǒng)進行定量分析和基因組規(guī)模模型建立；從對生產(chǎn)宿主在不同環(huán)境條件和遺傳擾動下細胞內部變化的理解，到利用所得到的數(shù)據(jù)進行菌種改造和過程優(yōu)化。

1.2 釀酒酵母的系統(tǒng)生物學研究與燃料乙醇生產(chǎn)

釀酒酵母是燃料乙醇生產(chǎn)最常用的工業(yè)宿主。對釀酒酵母的基因組學、蛋白組學和代謝組學研究獲得了很多有用的信息，為指導高效燃料生產(chǎn)菌種構建的代謝工程操作奠定了基礎。Jens Nilson研究小組構建了釀酒酵母基因組規(guī)模的系統(tǒng)生物學模型，并設計了降低甘油產(chǎn)率提高乙醇收率的代謝工程操作策略，進一步的代謝工程操作證明，在釀酒酵母中過量表達鏈球菌Streptococcus mutants的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPN獲得的突變體，甘油收率下降了40%，乙醇收率提高了 3%，在混合糖發(fā)酵基因工程菌中過量表達該基因，利用葡萄糖、木糖混合糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的收率提高了25%[12]。瑞典Lund University的研究小組對所構建的重組酵母與對照菌株進行了轉錄組學分析，發(fā)現(xiàn)在木糖上生長較好的菌株中有 13個基因在所有重組菌中變化都比較明顯，并進一步進行了這些基因的過量表達和敲除實驗，發(fā)現(xiàn)其中 5個基因的操作提高了在木糖上的有氧生長，最明顯的提高了173%[13]。

對在木糖上發(fā)酵良好的菌株S.cerevisiaeTMB3400與親本菌株進行了蛋白組學的分析，發(fā)現(xiàn)突變體中木糖脫氫酶、木糖還原酶以及TKL1和ALD6等酶基因的表達明顯上調，與前期對突變體的理性遺傳改造設計相符合，值得指出的是，該研究發(fā)現(xiàn)蛋白組研究的結果與同等實驗條件下的轉錄組研究結果不相符，表明釀酒酵母蛋白的翻譯后修飾或者轉錄后修飾過程對代謝的影響較大[14]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)在突變體和對照菌種中存在非釀酒酵母來源的蛋白，說明工業(yè)菌株中的蛋白和基因組成存在異質性，即工業(yè)微生物菌種與實驗室菌種存在基因組組成的差異。類似的結論也在其他研究中有所報道，如美國杜克大學對巴西利用甘蔗生產(chǎn)燃料乙醇的工業(yè)酵母JAY270和其單倍體菌株JAY291的基因組測序發(fā)現(xiàn)，與實驗室模式酵母菌種S288C相比較，JAY270菌株的染色體結構存在明顯差異，包括6號染色體上有9.1 kb和19.3 kb的大片段而在S288C中沒有發(fā)現(xiàn)，此外在JAY270中某些基因拷貝數(shù)增加，如負責細胞內重要的小分子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)循環(huán)的SAM4和SAM5基因在S288C中有2個拷貝，但在JAY270中有4個拷貝；負責微生物B6代謝的SNO2和SNZ2基因在JAY270中有9個拷貝，而在S288C中只有4個拷貝，同時還發(fā)現(xiàn)SNO2和SNZ2的表達在JAY270中也明顯高于模式酵母，而這兩個基因與細胞的氧化脅迫有關，其拷貝數(shù)的增加可能與 JAY270較強的耐受氧化脅迫的性能有關。另外HAP1調控的基因在JAY270中的表達也明顯高于 S288C，這些基因與發(fā)酵過程密切相關[15]。以上結果都表明，在工業(yè)酵母中存在有利于其進行工業(yè)發(fā)酵和抵抗工業(yè)生產(chǎn)過程中的脅迫耐受性的基因組成和表達調控方式，在構建基因組規(guī)模代謝模型的時候，應該充分考慮工業(yè)菌種與實驗室模式菌種的差異，以及不同酵母菌株間的差異，從而得到更完善的模型。

1.3 系統(tǒng)生物學在生物燃料生產(chǎn)菌耐性研究中的應用

系統(tǒng)生物學能提供對復雜系統(tǒng)的深刻認識，因此對多基因控制的性狀的研究能起到重要的推動作用。生物燃料生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)菌可能經(jīng)歷各種脅迫因素的壓力，首先燃料乙醇和生物丁醇等生物燃料本身對細胞就具有很大的毒性；其次，生產(chǎn)菌在工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中可能遇到的高溫和低pH等條件，原料水解物中存在的抑制性化合物，如糠醛、乙酸等[16-17]。提高生產(chǎn)菌對這些環(huán)境條件的耐受性，有助于提高發(fā)酵終點的產(chǎn)物濃度，同時降低生產(chǎn)的能耗，對于生產(chǎn)的經(jīng)濟性具有重要意義。近年來對釀酒酵母和梭菌等生物燃料生產(chǎn)菌的轉錄組學、蛋白組學和代謝組學研究結果對于深入了解細胞在環(huán)境脅迫下的反應，尋找關鍵基因進行代謝工程改造奠定了基礎[18-28]。雖然早期對實驗室菌株的研究集中在短暫乙醇沖擊下細胞全局基因轉錄的反應，但對工業(yè)酵母在工業(yè)發(fā)酵條件下的轉錄組學研究表明，不同菌株對乙醇脅迫的反應存在一定的可比性[18]，如乙醇脅迫下，細胞能量代謝、脂類代謝、細胞表面蛋白、細胞脅迫反應相關的基因均表達上調，值得指出的是，即使在過量糖存在條件下，糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑相關的很多基因的表達也出現(xiàn)上調，表明細胞在乙醇脅迫下能量代謝對細胞活性是非常關鍵的。

[6]Shi DJ, Wang CL, Wang KM.Genome shuffling to improve thermotolerance, ethanol tolerance and ethanol productivity ofSaccharomyces cerevisiae.J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36: 139?147.

值得提出的是，在系統(tǒng)生物學研究過程中，對細胞基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組等組學研究將獲得大量的信息，因此只有對所獲得的信息進行深入挖掘和整合，才有可能充分利用這些信息指導進一步的基因工程操作。Bonneau等提出了通過對不同環(huán)境因素下基因組表達水平動態(tài)變化的研究尋找控制細胞功能網(wǎng)絡模塊的轉錄因子的路線，對400多個微陣列數(shù)據(jù)進行分析，建立了包括72個轉錄因子和 9個環(huán)境因子的模型，成功預測了未知環(huán)境影響下細胞轉錄組的動態(tài)變化，證明了雖然復雜生物系統(tǒng)的描述給系統(tǒng)生物學研究帶來了挑戰(zhàn)，但細胞內部代謝網(wǎng)絡的變化與外部的環(huán)境擾動存在可預見的主要模式[29]，同時，這項研究也提示了利用系統(tǒng)生物學工具研究生物燃料生產(chǎn)菌的構建須緊密結合工業(yè)生產(chǎn)的實際環(huán)境條件，強調了工業(yè)生產(chǎn)相關環(huán)境下菌株的生理性能在菌株構建中的重要作用[2]。

2 合成生物學研究與生物燃料生產(chǎn)

雖然系統(tǒng)生物學可加深人類對復雜系統(tǒng)的認識，但系統(tǒng)生物學研究往往揭示了多個基因對復雜系統(tǒng)的調控，而對于多基因控制的系統(tǒng)進行代謝工程改造還存在周期長、效率低的問題，因而菌種的選育往往還需要依賴傳統(tǒng)的誘變、雜交以及菌種馴化等手段。雖然基因組改組和全局轉錄機制工程等技術可加快對微生物進行全基因組規(guī)模的改造，但這些操作仍然屬于非定向的改造，因此仍需要篩選大量的突變體。如果說系統(tǒng)生物學工具使人們可以最大限度地利用細胞的合成潛能，那么合成生物學的發(fā)展使人們可以利用物理學方法類似的模塊構建和組裝形成新的生命有機體，從而人工設計新的高效生命系統(tǒng)進行生物燃料的生產(chǎn)。2010年5月，美國生物學家Venter實驗小組宣布成功創(chuàng)造了世界上首個人造生命，即人工合成的1.08 Mbp絲狀支原體Mycoplasma mycoidesJCVI-syn1.0基因組在山羊支原體Mycoplasma capricolum細胞中成功表達，使這一新產(chǎn)生的生命能自我生長、繁殖，這是合成生物學發(fā)展史上的里程碑[30]，標志著人工制造生命體的技術已進入了一個新的時代。

2.1 合成生物學與系統(tǒng)生物學和代謝工程

[9]Lee SY, Lee DY, Kim TY.Systems biotechnology for strain improvement.Trends Biotechnol, 2005, 23: 349?358.

戴威的經(jīng)歷堪稱天之驕子，曾是北京大學學生會主席，創(chuàng)辦ofo時就立志要改變世界。戴威以30億元財富排名《2018胡潤80后富豪榜》第32位，可以說是最著名的90后創(chuàng)業(yè)者和企業(yè)家。

合成生物學與代謝工程操作存在部分交叉[33]。代謝工程操作可以合并來自不同生物的已有的途徑，并可以通過對已知途徑的改造生產(chǎn)新的產(chǎn)品，但合成生物學與代謝工程的最大差別是，合成生物學設計的代謝通路可以是全新的，不受已有生命系統(tǒng)中的代謝路徑的限制，即代謝途徑的每一步都可以獨立設計，目標是通過模塊的搭建快速配置生物機器。這一點對于生物燃料的生產(chǎn)非常重要，因為無論是燃料乙醇、生物丁醇還是生物柴油，其生物合成都受到細胞內部代謝的嚴格調控，而從頭設計代謝途徑可以避開這種代謝調控，而且可以在所設計的每一步反應中使用來自不同宿主的酶，或者通過蛋白質的定向進化獲得新的酶用于模塊的搭建。

系統(tǒng)生物學、合成生物學和代謝工程研究都可以促進生物燃料的生產(chǎn)效率，但側重點有所不同。如利用廉價底物，包括木質纖維素、糖蜜及其他農林廢棄物等生產(chǎn)生物燃料的過程中，代謝工程操作著眼于宿主細胞已有代謝途徑的敲除和/或過量表達，以及對底物轉運蛋白和產(chǎn)物轉運過程的修飾，系統(tǒng)生物學的研究可提供宿主細胞已經(jīng)代謝工程改造后的突變體細胞在不同培養(yǎng)條件和不同基因改造后的生理特征和產(chǎn)物合成情況，從而提供更多更有效的靶點用于代謝工程改造，而合成生物學則著眼于從頭設計全新的代謝途徑或全新的生命系統(tǒng)進行生物燃料的生產(chǎn)，同時也可以通過模塊的優(yōu)化和重建，改造原有的生命系統(tǒng)，進行生物燃料的有效生產(chǎn)。合成生物學與代謝工程的概念常被很多學者混淆，如在異源宿主中建立生物燃料的代謝途徑，早期的代謝工程研究已有很多這樣的例子，現(xiàn)在將其稱之為合成生物學研究，但是簡單地通過基因工程手段引入新的代謝途徑，實質上并沒有超越原來代謝工程定義的范疇。

供給情況：氮肥方面，尿素復產(chǎn)企業(yè)增多，整體開工率小幅上升至60%。磷肥方面，二銨企業(yè)開工率大穩(wěn)小動，平均開工率小幅上升至67%。鉀肥方面，鹽湖基準產(chǎn)品60%粉晶到站價與上周持平；港口鉀、邊貿鉀近期到貨均較少，市場供應緊俏。復合肥方面，企業(yè)整體開工率保持穩(wěn)定，各地限產(chǎn)壓力不減，大型企業(yè)開工穩(wěn)定，多數(shù)小企業(yè)持續(xù)停產(chǎn)。

2.2 合成生物學模塊的優(yōu)化與生物燃料生產(chǎn)

目前合成生物學還處于發(fā)展的初期階段，其主要的限制性因素在于：1)對生物元件(包括酶蛋白和啟動子等)特性的理解還不夠深入；2)所構建的代謝通路的不可預測性，如對基因調節(jié)元件的不可控制性；3)多個條件環(huán)路存在時構建與檢測的復雜性；4)不同元件的不可協(xié)調性；5)不同細胞間的可變性，由于細胞生理特性的差異導致構建的效果不一致[34]。但近期相關研究為利用合成生物學研究生產(chǎn)生物燃料奠定了良好基礎。利用合成生物學研究生物燃料生產(chǎn)有兩個重要組成因素：一個是所使用的宿主細胞，其次是所針對的代謝途徑[35]。利用大腸桿菌和酵母菌細胞工廠生產(chǎn)生物燃料的代謝工程操作已取得了很大的進步，但藻類生物也將成為生物燃料生產(chǎn)的有利宿主。美國學者James Liao 實驗室將 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因在細長聚球藻Synechococcus elongatusPCC7942中過量表達，使這種藍藻可以直接利用光能和CO2生產(chǎn)異丁醇[36]。與生物柴油不同，工程藻產(chǎn)生的異丁醇容易回收，生產(chǎn)過程無須經(jīng)過細胞破碎，極大地節(jié)省了成本，提高了生產(chǎn)效率，這也提示了藍藻可作為未來合成生物學手段構建生物燃料生產(chǎn)宿主的一個理想選擇。值得指出的是，以上研究中得到的異丁醇作為長鏈醇的一種，正成為新的生物燃料的研究熱點。長鏈醇是指包括含有四碳或五碳的直鏈醇或支鏈醇，包括丁醇、異丁醇、異戊醇等。與乙醇相比，長鏈醇具有更高的能量密度和更低的吸濕性，更適合作為汽油代替品。

[33]Prather KLJ, Martin CH.De novobiosynthetic pathways:rational design of microbial chemical factories.Curr opin Biotechnol, 2008, 19: 468?474.

在生物制氫研究方面，Zhang等利用13個酶的無細胞系統(tǒng)設計了自然情況下不存在的一系列反應生產(chǎn)了氫氣，氫氣收率大大高于生物發(fā)酵制氫，而且反應條件溫和(30℃，常壓)[39]。反應中使用的這13個酶催化的途徑是從頭設計的，雖然這個工作利用的是無細胞體系，但這個設計思路可用于利用合成生物學手段構建能生產(chǎn)這些酶的細胞體系，從而實現(xiàn)利用廉價的底物合成相關酶系，進一步降低生產(chǎn)成本。

3 展望

過去幾年見證了系統(tǒng)生物學和合成生物學的飛速發(fā)展，以及系統(tǒng)生物學工具在生物燃料生產(chǎn)菌株構建方面的應用[40-42]。系統(tǒng)生物學研究揭示了宿主在不同的發(fā)酵環(huán)境條件下和不同遺傳改造后整體細胞代謝網(wǎng)絡的調整情況，有助于識別關鍵的靶基因進行代謝工程改造。利用合成生物學手段定向設計和構建高效生物燃料生產(chǎn)菌的研究還需要依賴系統(tǒng)生物學提供更多相關代謝途徑和生產(chǎn)宿主的特性信息，以及基因組規(guī)模代謝工程操作對生物燃料合成途徑的優(yōu)化。

未來生物燃料生產(chǎn)菌株改造的一個重要目標是對木質纖維素資源的高效生物轉化。纖維素是地球上來源最豐富的生物質資源，可作為生物能源生產(chǎn)的廉價底物，降低大規(guī)模生產(chǎn)的成本。利用纖維素原料首先需要利用纖維素酶等降解酶系將纖維素分子轉變成可發(fā)酵利用的糖，而里氏木霉Trichoderma reesei是重要的纖維素酶生產(chǎn)菌種，其基因組序列的公布為相關的系統(tǒng)生物學研究奠定了良好的基礎[43]，但目前對絲狀真菌的組學研究還不夠深入，相關的基因組規(guī)模的代謝模型和基因組工程改造還處于起步階段[44]。隨著絲狀真菌遺傳改造系統(tǒng)的不斷完善，以及利用蛋白質工程人工設計酶分子技術的進步，提高纖維素酶的產(chǎn)量，以及優(yōu)化復合酶系統(tǒng)的組分比例，提高纖維素酶的活力等目標將逐步實現(xiàn)，纖維素生物質的高效轉化將成為可能[45]。近年來通過異源表達纖維素酶降解酶系，已經(jīng)在不同宿主系統(tǒng)中實現(xiàn)了纖維素原料的有效利用。美國加州大學伯克利分校的Keasling研究組通過整合木聚糖酶基因實現(xiàn)了在大腸桿菌生產(chǎn)生物柴油[46]，酵母菌細胞展示技術也可提供高效的降解酶系進行燃料乙醇的生產(chǎn)[47]，這些代謝工程研究的成功為未來利用合成生物學手段建立高效纖維素生物質轉化的細胞工廠提供了基礎。高效共發(fā)酵五碳糖和六碳糖的發(fā)酵菌株的構建也是未來生物燃料生產(chǎn)宿主構建的一個重點。自然環(huán)境中存在的某些微生物可以有效分解纖維素原料，尋找高效的降解酶系或者定向改造纖維素降解酶系，將為合成生物學構建高效菌株提供更好的生物組件。

可以預見，隨著系統(tǒng)生物學研究的不斷發(fā)展和更多組學數(shù)據(jù)的獲得，以及合成生物學研究的不斷成熟，更高效的生物燃料生產(chǎn)宿主將成功構建，生物質轉化效率將大幅度提高，生物能源生產(chǎn)過程的經(jīng)濟性也將得到明顯提高，從而使生物燃料能得到更廣泛的生產(chǎn)和應用。

[31]Wang JS, Qi QS.Synthetic biology for metabolic engineering: a review.Chin J Biotech, 2009, 25:1296?1302.王俊姝, 祁慶生.合成生物學與代謝工程.生物工程學報, 2009, 25: 1296?1302.

[1]Lynd LR, Laser MS, Bransby D,et al.How biotech cantransform biofuels.Nat Biotechnol, 2008, 26: 169?172.

[2]Zhang Y, Zhu Y, Zhu Y,et al.The importance of engineering physiological functionality into microbes.Trends Biotechnol, 2009, 27: 664?672.

系統(tǒng)代謝工程(Systems metabolic engineering)[10]：即利用計算機工具建立的基因組規(guī)模計量模型和基因工程操作對細胞進行系統(tǒng)規(guī)模的代謝工程改造，以生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。強調在對細胞代謝進行基因組規(guī)模的整體認識的基礎上進行代謝工程改造。

[4]Jarboe LR, Grabar TB, Yomano LP,et al.Development of ethanologenic bacteria.Adv Biochem Eng Biotechnol,2007, 108: 237?261.

[5]Jin YS, Alper H, Yang YT,et al.Improvement of xylose uptake and ethanol production in recombinantSaccharomyces cerevisiaethrough an inverse metabolic engineering approach.Appl Environ Microbiol, 2005, 71:8249?8256.

與實驗室菌株不同的是，工業(yè)菌株還存在長期發(fā)酵條件下對脅迫條件的適應相關基因表達的變化，而且相關基因很多都是在實驗室酵母中沒有發(fā)現(xiàn)的功能未知的新基因[28]，這再次提示了不同菌株遺傳背景和不同的環(huán)境條件對組學研究結果的影響。對脅迫耐受菌株與野生型的轉錄組學和/或蛋白組學比較研究，可發(fā)現(xiàn)與脅迫反應和脅迫耐受性相關的基因和/或蛋白，加深對脅迫耐受機理的認識，同時通過對關鍵靶基因的改造，可有效提高生產(chǎn)菌的脅迫耐受性。如對實驗室菌株和工業(yè)釀酒酵母菌株在 5%乙醇中轉錄組學分析揭示，酪氨酸生物合成基因可能與乙醇耐性密切相關，進一步對相關基因進行過量表達或者添加酪氨酸，發(fā)現(xiàn)菌株對乙醇的耐受性的確得到了提高[20]。目前國內外對乙醇、丁醇以及纖維素水解物中乙酸和糠醛等抑制性物質對生產(chǎn)菌株全基因組的表達影響研究非?；钴S[20-28]，這些研究揭示了大量差異表達的基因和蛋白，為進一步深入研究提高生產(chǎn)菌株的脅迫耐受性，選育生產(chǎn)效率提高的工業(yè)菌株提供了基礎。

[7]Alper H, Moxley J, Nevoigt E,et al.Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production.Science, 2006, 314: 1565?1568.

[8]Zhao XQ, Jiang RJ, Bai FW.Directed evolution of promoter and cellular transcription machinery and its application in microbial metabolic engineering–a review.Chin J Biotech, 2009, 25: 1312?1315.趙心清, 姜如嬌, 白鳳武.啟動子和細胞全局轉錄機制的定向進化在微生物代謝工程中的應用.生物工程學報, 2009, 25: 1312?1315.

合成生物學的基本研究思路是利用生物零件(Parts)，如啟動子、核糖體結合位點、RNA、酶編碼基因等組裝成裝置(Devices)，即代謝途徑或調解環(huán)路，并將裝置進一步組建成生命系統(tǒng)(Systems)，包括根據(jù)人類的意愿從頭設計合成新的生命過程或生命體，以及對現(xiàn)有生物體進行重新設計[31]。合成生物學其核心是按照工程學的方法設計和改造生命系統(tǒng)，而且這個生命系統(tǒng)的特征是可以預測的。然而成功組建生命系統(tǒng)的前提是對復雜生命系統(tǒng)的深刻認識。系統(tǒng)生物學研究所獲得的大量不同水平的信息可作為理解生命系統(tǒng)的基礎，在這個基礎上合成生物學才可能成功加工制作復雜的生物機器[32]。

一般情況下，曲折蜿蜒的天然河道是由淺灘和深槽兩種形態(tài)構成，二者呈交替狀態(tài)分布。淺灘中常會有淤積，往往成為河道治理的重點，深槽則能保護水道與河床。除此之外，淺灘由于光照充足，成為兩棲動物、鳥類繁衍和棲息的地方。深槽可為微生物提供良好的有機物分解空間，同時能夠滿足水生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)物質供給。河道由于溫度、光照及養(yǎng)料的供給，實現(xiàn)了生物物種的多樣性。

[10]Kim TY, Sohn SB, Kim HU.Strategies for systems-level metabolic engineering.Biotechnol J, 2008, 3: 612?623.

田有園細細地跟易非說著，聽了他的話，易非仿佛才醒悟，如果按照自己的思路，她將來就只能睡在沙發(fā)上，媽要招呼小孫子，她能讓爸爸的長孫睡在客廳里嗎？

[11]Otero JM, Nielsen J.Industrial systems biology.Biotech Bioeng, 2010, 105: 439?447.

[12]Bro C, Regenberg B, F?rster J,et al.In silico aided metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiaefor improved bioethanol production.Metab Eng, 2006, 8:102?111.

[13]Bengtsson O, Jeppsson M, Sonderegger M,et al.Identification of common traits in improved xylosegrowingSaccharomyces cerevisiaefor inverse metabolic engineering.Yeast, 2008, 25: 835?847.

[14]Karhumaa K, P?hlman AK, Hahn-H?gerdal B,et al.Proteome analysis of the xylose-fermenting mutant yeast strain TMB 3400.Yeast, 2009, 26: 371?382.

雖然循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤DNA和microRNA、外泌體等新興血液生物標志物檢測因其無創(chuàng)性和低風險性逐漸興起，但其臨床應用仍然相對較少[10]，而血清腫瘤標志物仍然是胰腺癌中應用最為廣泛的生物標志物[11]。

[15]Argueso JL, Carazzolle MF, Mieczkowski PA,et al.Genome structure of aSaccharomyces cerevisiaestrain widely used in bioethanol production.Genome Res, 2009,19: 2258?2270.

[16]Fischer CR, Klein-Marcuschamer D, Stephanopoulos G.Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production.Metab Eng, 2008, 10: 295?304.

[17]Nicolaou SA, Gaida SM, Papoutsakis ET.A comparative view of metabolite and substrate stress and tolerance in microbial bioprocessing: from biofuels and chemicals, to biocatalysis and bioremediation.Metab Eng, 2010, 12:307?331.

[18]Zhao XQ, Bai FW.Mechanism of yeast ethanol tolerance and its manipulation for efficient fuel ethanol production.J Biotechnol, 2009, 27: 849?856.

[19]Mao S, Luo Y, Zhang T,et al.Proteome reference map and comparative proteomic analysis between a wild typeClostridium acetobutylicumDSM 1731 and its mutant with enhanced butanol tolerance and butanol yield.J Proteome Res, 2010, 9: 3046?3061.

[20]Hirasawa T, Yoshikawa K, Nakakura Y,et al.Identification of target genes conferring ethanol stress tolerance toSaccharomyces cerevisiaebased on DNA microarray data analysis.J Biotechnol, 2007, 131: 34?44.

[21]Pham TK, Wright PC.The proteomic response ofSaccharomyces cerevisiaein very high glucose conditions with amino acid supplementation.J Proteome Res, 2008,7: 4766?4774.

李波：東川紅土地景區(qū)，位于東川西南部，原屬新田鄉(xiāng)和法者鄉(xiāng)，2005年兩鄉(xiāng)合并后改稱“紅土地鎮(zhèn)”。2011年昆明市成立“倘甸產(chǎn)業(yè)園區(qū)及轎子山旅游開發(fā)區(qū)”（簡稱“兩區(qū)”），此后，紅土地鎮(zhèn)又交由“兩區(qū)”托管。紅土地景區(qū)分散，加起來大約100平方公里。景點主要有水坪子的梯田（月亮田），陷塘地的落霞溝，花溝的老龍樹，花石頭的錦繡園，大埡口的五彩地、還有119道班的打馬坎。

[22]Li BZ, Yuan YJ.Transcriptome shifts in response to furfural and acetic acid inSaccharomyces cerevisiae.Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86: 1915?1924.

[23]Lin FM, Qiao B, Yuan YJ.Comparative proteomic analysis of tolerance and adaptation of ethanologenicSaccharomyces cerevisiaeto furfural, a lignocellulosic inhibitory compound.Appl Environ Microbiol, 2009, 75:3765?3776.

[24]Ding MZ, Tian HC, Cheng JS,et al.Inoculum size-dependent interactive regulation of metabolism and stress response ofSaccharomyces cerevisiaerevealed by comparative metabolomics.J Biotechnol, 2009, 144:279?286.

有機硅也就是有機硅化合物，就是含有碳硅鍵的有機硅化合物，在所有生物分子中還沒有找到含碳硅鍵的化合物，所以它是一種特殊的高分子化工材料。

[25]Alexandre H, Ansanay GV, Dequin S,et al.Global gene expression during short-term ethanol stress inSaccharomyces cerevisiae.FEBS Lett, 2001, 498: 98?103.

●在五原縣豐裕鄉(xiāng)萬畝蜜瓜使用了硅谷功能肥，打造了萬畝“大蜜豐?！钡乩順酥井a(chǎn)品。每畝增產(chǎn)20%，糖度增加2個點以上，經(jīng)有關部門現(xiàn)場檢測達到綠色無公害標準，產(chǎn)品被全國各地收購商搶購，創(chuàng)造了一年雙季蜜瓜的奇跡，每斤瓜高于市場價格0.5元，春季大棚密瓜畝收入13500元，創(chuàng)歷史新高。

[26]Chandler M, Stanley GA, Rogers P,et al.A genomic approach to defining the ethanol stress response in the yeastSaccharomyces cerevisiae.Ann Microbiol, 2004, 54:427?454.

[27]Wu H, Zheng X, Araki Y,et al.Global gene expression analysis of yeast cells during sake brewing.Appl EnvironMicrobiol, 2006, 72: 7353?7358.

[28]Marks VD, Sui H, Erasmus D,et al.Dynamics of the yeast transcriptome during wine fermentation reveals a novel fermentation stress response.FEMS Yeast Res, 2008, 8:35?52.

[29]Bonneau R, Facciotti MT, Reiss DJ,et al.A predictive model for transcriptional control of physiology in a free living cell.Cell, 2007, 131: 1354?1365.

[30]Gibson DG, Glass JI, Lartigue C,et al.Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome.Science, 2010.DOI: 10.1126/science.1190719.

REFERENCES

[32]Barrett CL, Kim TY, Kim HU,et al.Systems biology as a foundation for genome-scale synthetic biology.Curr Opin Biotechnol, 2006, 17: 488?492.

重建生物燃料合成途徑的一個典型例子是在酵母菌中對丁醇代謝途徑的搭建[37]。美國加州大學伯克利分校的 Keasling教授研究組研究了來自放線菌、大腸桿菌、釀酒酵母、梭菌等不同生物的不同酶基因組合由乙酰輔酶 A合成丁醇的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)其中特定組合的酶可產(chǎn)生最高水平的丁醇(2.5 mg/L)。雖然產(chǎn)量還非常低，但是這項研究體現(xiàn)了利用合成生物學手段構建細胞系統(tǒng)中優(yōu)化生物學元件的重要性。對長鏈醇的代謝工程研究為合成生物學優(yōu)化也為搭建生物燃料代謝途徑的模塊優(yōu)化提供了很好的借鑒。美國加州大學洛杉磯分校的James Liao研究組在大腸桿菌中引入了2-酮酸脫酸酶(KDCs)和乙醇脫氫酶ADH，從而可利用宿主菌氨基酸合成的中間產(chǎn)物2-酮酸生產(chǎn)多種長鏈醇[38]。這項代謝工程研究的成功提示利用合成生物學手段建立新的代謝途徑的可行性。

[34]Kwok R.Five hard truths for synthetic biology.Nature,2010, 463: 288?290.

[35]Khalil AS, Collins J.Synthetic biology, applications come of age.Nat Rev Genet, 2010, 11: 367?379.

[36]Atsumi S, Higashide W, Liao JC.Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde.Nat Biotechnol, 2009, 27: 1177?1180.

[37]Steen EJ, Chan R, Prasad N,et al.Metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiaefor the production of n-butanol.Microb Cell Fact, 2008, 7: 36.

[38]Atsumi S, Hanai T, Liao JC.Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.Nature, 2008, 452: 86?90.

[39]Zhang YHP, Evans BR, Mielenz JR,et al.High-yield hydrogen production from starch and water by a synthetic enzymatic pathway.PLoS ONE, 2007, 2: e456.doi:10.1371/journal.pone.0000456.

[40]Mukhopadhyay A, Redding AM, Rutherford BJ,et al.Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production.Curr Opin Biotechnol, 2008, 19:228?234.

[41]Dellomonaco C, Fava F, Gonzalez R.The path to next generation biofuels: successes and challenges in the era of synthetic biology.Microb Cell Fact, 2010, 9: 3.

[42]Clomburg JM, Gonzalez R.Biofuel production inEscherichia coli: the role of metabolic engineering and synthetic biology.Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86:419?434.

本地區(qū)番茄無公害栽培中，春季栽培采用蔬菜大棚栽培，大概在12月到第二年3月期間播種；播種期間，結合當?shù)貧夂驐l件選擇播種時間，番茄開花期間避免高溫和雨季天氣。秋季番茄在8月份播種，也可以在6月份提前播種，以此來提升經(jīng)濟效益。番茄植株生長期間，需要充足的水分，而番茄枝葉繁茂，蒸騰作用強，所以無論是莖葉還是果實都需要充足的水分，如果水分不足將影響果實膨大，嚴重情況下會降低番茄的產(chǎn)量和品質。除了水分以外，養(yǎng)分的支持同樣十分關鍵，番茄是一種耐肥作物，所以生長期間需要保證充足的肥料支持，實現(xiàn)氮、磷、鉀肥合理搭配。

[43]Martinez D, Berka RM, Henrissat B.Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungusTrichoderma reesei(syn.Hypocrea jecorina).Nat Biotechnol, 2008, 26: 553?560.

[44]Jouhten P, Pitk?nen E, Pakula T,et al.13C-metabolic flux ratio and novel carbon path analyses confirmed thatTrichoderma reeseiuses primarily the respirative pathway also on the preferred carbon source glucose.BMC Syst Biol, 2009, 3: 104.

[45]Wen F, Nair N, Zhao H.Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production.Curr Opin Biotechnol, 2009, 20: 412?419.

[46]Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G,et al.Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass.Nature, 2010, 463: 559?562.

表3為不同上錐段底角壓降及分離效率對比。由表3可以看出，上錐段底角由55°減小到50°，壓降增加了6.21%，分離效率提高了1.87%；上錐段底角由50°減小到45°，壓降增加了3.22%，分離效率提高了7.57%；上錐段底角由45°減小到40°，壓降下降了18.88%，分離效率下降了11.94%，原因在于適當?shù)臏p少上錐段底角有利于增大旋流器內切向速度從而提高分離效率，不過過小的上錐段底角，反而會使中心錐結構附近渦流增多，使其切向速度下降，降低了分離效率，說明上錐段底角在40°～50°間存在著一個最佳角度。

[47]Wen F, Sun J, Zhao H.Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol.Appl Environ Microbiol, 2010, 76: 1251?1260.

Journals.im.ac.cn

Application of systems biology and synthetic biology in strain improvement for biofuel production

Xinqing Zhao1, Fengwu Bai1, and Yin Li2
1 School of Life Science and Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China 2 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Received:June 9, 2010;Accepted:June 13, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA10Z358), National Natural Science Foundation of China(No.30500011).

Corresponding author:Yin Li.Tel: +86-10-64807485; E-mail: yli@im.ac.cn國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2007AA10Z358)，國家自然科學基金(No.30500011)資助。