徐麗麗，沈煜，鮑曉明

山東大學 微生物技術國家重點實驗室，濟南 250100

釀酒酵母纖維素乙醇統(tǒng)合加工(CBP)的策略及研究進展

徐麗麗，沈煜，鮑曉明

山東大學 微生物技術國家重點實驗室，濟南 250100

木質纖維素乙醇的統(tǒng)合生物加工過程(Consolidated bioprocessing，CBP)是將纖維素酶和半纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和乙醇發(fā)酵過程組合或部分組合，通過一種微生物完成。統(tǒng)合生物加工過程有利于降低生物轉化過程的成本，越來越受到研究者的普遍關注。釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵菌株。介紹了影響外源基因在釀酒酵母中表達水平的因素，纖維素酶和半纖維素酶在釀酒酵母中表達研究進展及利用釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的策略。

木質纖維素，統(tǒng)合生物加工，纖維素酶系，纖維素乙醇，釀酒酵母

Abstract:Ethanol production from lignocelluloses of consolidated bioprocessing(CBP)is a system in which cellulase and hemicellulase production, substrate hydrolysis, and fermentation are combined or partially combined by ethanologen microorganisms that express cellulolytic or hemicellulolytic enzymes or engineering cellulolytic microorganisms with ethanol production properties.Due to its potential for significant cost reduction, CBP is receiving more and more attention.In this review article, we discuss the factors that influence the expression level of cellulases inSaccharomyces cerevisiaeand updated progress in bioethanol production from lignocellulose by the CBP strategy using the yeast species.

Keywords:lignocelluloses, consolidated bioprocessing, cellulases, lignocellulosic ethanol,Saccharomyces cerevisiae

新型能源的開發(fā)利用是當目前人類面對能源、環(huán)境及糧食等問題所采取的積極措施，作為主要生物能源的燃料乙醇，由于其獨特的車用性質而受到廣泛關注。利用豐富廉價的可再生木質纖維素生產(chǎn)乙醇，是規(guī)?；l(fā)展車用燃料乙醇的基礎。木質纖維素是地球上最豐富的可再生資源，占地球總生物量的40%左右，高效、廉價地利用木質纖維素轉化為如燃料乙醇等化工產(chǎn)品，是由石油基向生物基經(jīng)濟社會過渡的基礎。

木質纖維素中單純由葡萄糖組成的纖維素所占的比例最高，為 33%～51%，但其復雜的晶體結構為纖維素乙醇加工過程增加了困難，一般情況下，可以通過部分水解木質素和半纖維素，破壞纖維素結晶結構的理化預處理過程來解決。在此基礎上，通過糖化酶(纖維素酶與半纖維素酶)對纖維素和半纖維素的水解以及微生物對己糖、戊糖的乙醇發(fā)酵，完成纖維素乙醇生產(chǎn)過程。一般情況下，糖化和發(fā)酵2個步驟可以通過同步糖化發(fā)酵(Simultaneous saccharification and fermentation，SSF)或同步糖化共發(fā)酵(Simultaneous saccharification and cofementation，SSCF)的工藝一次完成。但SSF和SSCF工藝的前提是必須建立另外的纖維素酶和半纖維素酶的生產(chǎn)工藝[1]。將纖維素酶和半纖維素酶生產(chǎn)、水解和乙醇發(fā)酵組合或部分組合在一起完成，被稱為木質纖維素乙醇的統(tǒng)合生物加工過程(Consolidated bioprocessing，CBP)，由于統(tǒng)合生物加工簡化了加工過程，降低了能耗，有利于降低生物轉化過程的成本，越來越受到研究者的普遍關注[1-3]。

自然界主要通過產(chǎn)生纖維素酶系的微生物降解木質纖維素，不同物種的纖維素降解酶系組成及水解性質都有很大的差異。纖維素和半纖維素結構復雜，其水解涉及的酶的種類繁多(圖1)，其基本過程是纖維素在內切葡聚糖酶(Endoglucanases，EC 3.2.1.4，來自真菌的簡稱EG; 來自細菌的簡稱Cen)和纖維二糖水解酶(Cellobiohydrolases，又稱外切葡聚糖酶，Exoglucanases，EC 3.2.1.91，來自真菌的簡稱 CBH; 來自細菌的簡稱 Cex)的協(xié)同作用下，產(chǎn)生纖維二糖和一些纖維寡糖，進而 β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，簡稱 BG，EC 3.2.1.21)水解產(chǎn)生葡萄糖。另外預處理后未去除的半纖維素也需要在半纖維素酶的作用下產(chǎn)生糖分，最終糖分經(jīng)微生物發(fā)酵轉化成乙醇[2,4]。纖維素(半纖維素)酶系及降解過程的復雜性，表明實現(xiàn)木質纖維素乙醇的CBP是有一定難度的。

圖1 纖維素(a)與半纖維素(b、c、d)的復雜結構及其水解所涉及的酶類[5-6](纖維素(a)以及阿拉伯糖糖基木聚糖(b)、半乳甘露聚糖(c)、木葡聚糖(d)等半纖維素結構顯示存在不同形式的側鏈)Fig.1 Complex structure of cellulose and hemicelluloses and the enzymes involved in their degradation[5-6].Cellulose(a)and hemicellulose(b),(c)and(d)depicting the different side chains of arabinoxylan, galactomannan and xyloglucan, respectively.

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株，具有許多優(yōu)良的生產(chǎn)性能，如在厭氧條件下較好的生長能力，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生較高的乙醇得率和生產(chǎn)速率，具有較高的乙醇和其他抑制物耐受性，被公認為食品安全性 GRAS(Generally Regarded As Safe)微生物等，這些優(yōu)點使得釀酒酵母成為統(tǒng)合生物加工研究的首選微生物，將釀酒酵母作為統(tǒng)合生物加工載體的主要要求是在釀酒酵母中高效分泌表達木質纖維素水解酶[1]。以下綜述了影響外源基因在釀酒酵母中表達水平的因素，纖維素水解酶在釀酒酵母中表達方面的研究進展及利用釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的策略。

1 影響外源基因在釀酒酵母中表達水平的因素

外源基因在釀酒酵母中的表達水平受很多因素影響，主要從以下幾方面考慮：

1.1 外源基因的序列特性

不同生物對同一氨基酸不同密碼子的使用頻率不同，表現(xiàn)出不同的密碼子偏好性。外源基因的密碼子不一定適合釀酒酵母的密碼子偏好性，影響了外源基因的表達水平[7]，通過密碼子優(yōu)化可以提高外源基因在釀酒酵母中的表達，如 Kotula等[8]將小鼠來源的免疫球蛋白 κ鏈基因密碼子優(yōu)化成釀酒酵母偏好的密碼子，優(yōu)化的κ鏈基因在釀酒酵母F762菌株中，其合成速率提高了 5倍，蛋白質穩(wěn)定性提高了至少 50倍。Wiedemann等[9]將地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis的 L-阿拉伯糖異構酶基因araA和大腸桿菌的L-核酮糖激酶基因araB、L-核酮糖-5-P-4-差向異構酶基因araD進行密碼子優(yōu)化，在釀酒酵母中建立優(yōu)化的L-阿拉伯糖代謝途徑，與天然基因的途徑相比，重組菌株能更好地轉化 L-阿拉伯糖。

1.2 外源基因的拷貝數(shù)

無容置疑，外源基因的拷貝數(shù)勢必影響其在釀酒酵母中的表達水平，通過不同類型的質?？梢钥刂仆庠椿虻目截悢?shù)，例如以 2 μ質粒自主復制區(qū)為骨架的附加體質粒在釀酒酵母中可以維持大約100個拷貝[10-11]，而相應的以著絲粒區(qū)為骨架的著絲粒質粒僅能維持1～2個拷貝[12]。對于二(多)倍體、野生型釀酒酵母工業(yè)菌株而言，外源基因的穩(wěn)定高效表達是保持其生產(chǎn)特性的基礎，一般地，通過高拷貝整合可以實現(xiàn)。高拷貝整合策略是依據(jù)釀酒酵母高頻率同源重組的特性，利用染色體上DNA重復序列如rDNA[13-16]或δ-序列[17]作為整合位點。rDNA單元編碼rRNA，是酵母基因組中度重復的DNA序列，在單倍體酵母基因組中大約有 140～200個拷貝的 rDNA，這種整合方式可以使外源基因的穩(wěn)定性達到99%以上[18]；δ-序列是釀酒酵母Ty反轉錄轉座子的長末端序列，在單倍體酵母基因中有400多個拷貝，可使更多的目的基因拷貝整合到酵母基因組中[19]。

另外，利用Cre-loxP標記基因去除重組系統(tǒng)，可以在釀酒酵母基因組中不同的非必需 DNA區(qū)域中，或者二(多)倍體細胞的同源染色體間，反復插入外源基因，也可以實現(xiàn)定量控制外源基因多個拷貝的整合表達[20]。本實驗室通過該系統(tǒng)，將木糖代謝的關鍵酶基因，整合在二倍體工業(yè)菌株中同源染色體上的GRE3基因區(qū)域，不僅敲除了對副產(chǎn)物木糖醇積累有關的醛糖還原酶基因GRE3，同時使外源基因表達量有所提高。

1.3 表達水平的調控

啟動子是基因表達最重要的調控元件，通過選擇不同強度的啟動子可以控制外源基因的表達量，本課題組分別將釀酒酵母自身的TEF1、PGK1、HXK2和HXT7這4種不同的啟動子置換了木酮糖激酶基因XKS1的啟動子，實時熒光定量PCR檢測結果顯示，XKS1的表達量與天然啟動子狀態(tài)下相比，依次提高了 47.8±6.8、34.5±9.2、11.1±2.4、2.2±0.2倍，該實驗結果驗證了啟動子對基因的表達水平的調控，但這種啟動子的選擇并不能精確地控制基因的表達量。另外通過選擇組成型或誘導型啟動子可以控制外源基因的表達方式，對細胞生長不利的外源蛋白，一般選用誘導型啟動子；以追求高外源基因表達量為目的，一般選用組成型的強啟動子，例如糖酵解途徑中的關鍵酶啟動子。而對于關注代謝產(chǎn)物即代謝工程研究的相關酶基因的表達，則應控制在適當?shù)乃?，有必要選用合適的啟動子以及合適的轉錄調控因子調控每個外源基因的表達[21]。

1.4 外源基因對酵母細胞生命活動的影響

某些外源基因的高表達會影響酵母的正常生命活動，Nakajima等[22]報道，將環(huán)狀芽胞桿菌Bacillus circulans的β-1,3-葡聚糖酶基因(bglH)在釀酒酵母中分泌表達，所分泌的β-1,3-葡聚糖酶使酵母細胞生長受到抑制并且細胞膨脹，推測由于酵母細胞壁中的β-1,3-葡聚糖被表達的β-1,3-葡聚糖酶降解導致細胞變小，囊泡膨脹。釀酒酵母中多個基因的共表達是釀酒酵母分子改造包括CBP酵母的所需的重要策略[23]，但在酵母細胞中表達多個外源基因，可能會增加細胞的負擔，影響細胞的生長及(或)代謝，但內在分子機制尚不清楚。

1.5 受體菌分泌途徑及分泌過程中蛋白質的正確加工

蛋白質的分泌過程是在蛋白質合成的基礎上，在信號肽的引導下，進入內質網(wǎng)進行折疊、糖基化等修飾，并通過質量控制系統(tǒng)(Quality control system，QC system)檢測，正確折疊的蛋白進入胞內蛋白運輸途徑及分泌后信號肽剪切過程[24]。

信號肽是蛋白分泌的必要因素。相對于許多絲狀真菌而言，釀酒酵母蛋白分泌系統(tǒng)并不強，常用的信號肽有酸性磷酸脂酶(PHO5)、蔗糖酶(SUC2)、α因子(MFα1)和 Killer毒素等中的內源性信號肽[25]Kotula等[8]利用蔗糖酶信號肽，成功實現(xiàn)小鼠免疫球蛋白κ鏈的分泌表達。異源信號肽包括外源基因在天然菌株中自身的信號肽，也是外源蛋白在釀酒酵母分泌表達的常用策略。劉懷偉等[26]通過馬克斯克魯維酵母Kluyveromyces marxianus的菊粉酶信號肽(INU1A)，成功引導腐皮鐮孢菌Fusarium solani殼聚糖酶基因CSN的cDNA在釀酒酵母的分泌表達。Penttil?等[27]通過基因的天然信號肽，成功引導瑞氏木霉Trichoderma reeseiCBH II基因在釀酒酵母中的分泌表達。但有觀點認為，外源蛋白自身的信號肽引導的蛋白分泌效率低，重組蛋白較易降解。應該說，由于分泌蛋白自身結構的特點以及信號肽分泌效率的差異，對特異蛋白而言信號肽的選擇尚需要仔細研究定奪。

所有的蛋白質都要正確折疊才能分泌行使正確功能，錯誤折疊的分泌性蛋白不僅會被細胞中的內質網(wǎng)偶聯(lián)的蛋白降解機制降解，還會激發(fā)胞內的非折疊蛋白應答機制[28]。Schr?der報道[29]超表達多個助折疊蛋白和伴侶蛋白(如Bip、PDIs等)對于不同外源蛋白的表達可能產(chǎn)生更有效的促進作用。

胞內蛋白質運輸又叫膜泡運輸，新合成的蛋白質多肽鏈-核糖體復合物通過 N-末端信號肽序列與信號識別顆粒(SRP)及其受體(SR)相互作用穿過內質網(wǎng)膜上的易位子隧道進入到內質網(wǎng)腔中進行進一步的加工修飾，蛋白質被分揀運輸?shù)郊毎砻孢^程中的每一個運輸步驟和小泡的準確定位都是由許多胞內膜蛋白控制的，運輸途徑中的非有效運輸和錯誤分揀經(jīng)常導致目標蛋白滯留，其中Vps10蛋白偶聯(lián)的Golgi-to-Vacuole誤分揀途徑可能會導致分泌性蛋白在釀酒酵母空泡中積累[30]。有很多文獻報道在釀酒酵母中敲除VPS10基因對于外源蛋白表達有促進作用[31-33]。

另外一個制約外源蛋白從酵母細胞中有效分泌的因素就是被宿主蛋白酶降解，這個過程容易被環(huán)境脅迫尤其是高密度發(fā)酵過程誘導進行[24]。優(yōu)化培養(yǎng)條件、構建蛋白酶缺陷型菌株，均可以減少宿主的這種特異性降解[34-36]。

蛋白質糖基化是釀酒酵母分泌途徑中最主要的翻譯后修飾加工過程，包括O-糖基化及N-糖基化修飾，而其中在一系列作用于不同位點的甘露糖基轉移酶的催化下，可以形成 50個以上甘露糖鏈，容易對外源蛋白造成過度甘露糖化進而影響蛋白質的性質[37]。

2 纖維素酶和半纖維素酶在釀酒酵母中的表達

由于釀酒酵母具有良好的將糖轉化為乙醇的發(fā)酵性能，因此釀酒酵母纖維素乙醇統(tǒng)合加工(CBP)主要的菌株改造策略是實現(xiàn)木質纖維素水解酶類在其中的高效表達，由于纖維素酶和半纖維素酶作用的底物是不溶性的大分子，因此分泌表達是一個基本要求。

2.1 纖維素酶在釀酒酵母中的表達

纖維二糖水解酶(CBH)是從纖維素末端水解產(chǎn)生纖維二糖，外切葡聚糖酶的有效分泌是CBP酵母可行性的關鍵[5]。一般地，經(jīng)過適當折疊的外源蛋白需要糖基化才能行使生物功能。對瑞氏木霉而言，適度的O-糖基化修飾有利于纖維素酶分泌[38]，但釀酒酵母具有獨特的糖基化修飾系統(tǒng)，容易對外源蛋白造成過度甘露糖基化[39]。糖基化修飾對于蛋白質功能的影響有物種特異性，釀酒酵母中過度N-糖基化對外源蛋白表達的影響因蛋白而異，而纖維素酶過度糖基化主要影響其底物結合能力，也可能會影響其他方面的酶學性質。多種來源的CBH基因已經(jīng)在釀酒酵母中成功分泌表達，并通過對受體菌的分子改造，以減少過度糖基化對CBH的影響。

Penttil?等[27]將瑞氏木霉的CBH II基因構建到釀酒酵母表達載體上，通過其天然的信號肽在釀酒酵母中分泌表達，在5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)基中檢測到大約有100 mg/mL CBH II蛋白，且被過度N-糖基化修飾。重組表達的CBH II能降解無定形纖維素，但與天然CBH II相比，其對微晶纖維素的結合能力下降，推測與酶的過度 N-糖基化有關。Hong等[40]將嗜熱子囊菌Thermoascus aurantiacus的CBH IcDNA在釀酒酵母 3-磷酸甘油醛脫氫酶的GAPDH基因的啟動子的控制下，通過高拷貝附加體質粒，轉化釀酒酵母，培養(yǎng)基中沒有檢測到CBH I的活性，推測是外源蛋白表達量較低。但濃縮純化后的重組CBH I在65℃條件下孵育1 h仍能保持大于 80%的初始活性，同時發(fā)現(xiàn)該重組酶被過度 N-糖基化，酶解去糖基化后，酶在65℃條件穩(wěn)定性明顯下降，推測過度糖基化使其熱穩(wěn)定性發(fā)生變化。

釀酒酵母中外源蛋白的過度N-糖基化是在高爾基體中由糖基轉移酶催化完成的，如可以將起始的甘露糖殘基轉移到N-葡聚糖中間體(Man8GlcNAc2)上的OCH1基因編碼的 α-1,6-甘露糖基轉移酶、MNN1基因編碼的α-1,3-甘露糖基轉移酶，MNN4基因編碼的磷酸甘露糖基轉移酶Mnn6p的正調節(jié)蛋白以及KRE2基因編碼的α-1,2-甘露糖基轉移酶等一系列糖基轉移酶，其中主要是甘露糖基轉移酶。敲除釀酒酵母糖基轉移酶可以緩解對外源蛋白的過度糖基化。Nagasu等[41]敲除OCH1、MNN1和MNN4阻斷了外側糖鏈延伸，緩解外源蛋白的過度N-甘露糖基化，有利于提高酶活。Heinzelman等[42]將瑞氏木霉CBH II基因轉入敲除KRE2基因的釀酒酵母受體菌中，與出發(fā)菌株相比，其產(chǎn)生的重組CBH II大小由55 kDa左右變?yōu)?8 kDa左右。本課題組將攜帶CBH II基因的高拷貝質粒，分別在敲除了KRE2基因的及原初的釀酒酵母實驗室菌株中表達，前者所產(chǎn)生重組CBH II的酶活提高了約0.82倍。

相比而言，在釀酒酵母中表達內切葡聚糖酶(EG)成功的例子更多，無論是真菌源的或細菌源的，酶活也比 CBH 的高幾個數(shù)量級[43-48]。Panttil?等[43]將瑞氏木霉的EG I基因和EG III基因均在PGK1啟動子控制下，通過其天然的信號肽在釀酒酵母中分泌表達，重組酵母能向培養(yǎng)基中分泌有活性的EG I和EG III，但與天然的EG I相比，釀酒酵母產(chǎn)生的重組EG I蛋白相比分子量較大，同樣發(fā)生了不同程度的過度 N-糖基化。Mochizuki等[44]將隱球菌黃曲霉Cryptococcus fl avus的內切纖維素酶基因CMC1在GAP啟動子的控制下，克隆到含有δ-序列的表達載體上，通過 δ-序列整合到釀酒酵母單倍體基因組上，重組酵母分泌產(chǎn)生的 CMC酶活大約為12 500 U/L，比酶活約為1 390 U/g DCW，通過δ-序列整合表達的CMC酶活是YEp類型質粒分泌表達的CMC酶活的1.4倍。

在纖維素降解過程中，β-葡萄糖苷酶的催化作用是一個限速步驟，可將內切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶作用產(chǎn)生的纖維二糖降解成葡萄糖，有利于緩解纖維二糖對內切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的反饋抑制[49]。Shen等[15]將扣囊腹膜酵母菌Sacchromycopsis fibuligera的 β-葡萄糖苷酶基因BGL1克隆到帶有PGK1強啟動子的高拷貝整合型質粒上，通過 rDNA區(qū)整合到釀酒酵母二倍體工業(yè)菌株N27染色體上，重組BGL1比酶活達到1.02 IU/mg總蛋白。表達BGL1基因的酵母工程菌株N227能在48 h內將6.2 g/L纖維二糖消耗掉，產(chǎn)生3.3 g/L的乙醇，乙醇得率達到 0.532 g/g，接近理論值0.538 g/g。van Rooyen等[50]將扣囊復膜酵母菌的BGL1基因和白曲霉Aspergillus kawachii的BGL A基因分別在釀酒酵母中分泌表達，表達BGL1基因的重組酵母在含5 g/L纖維二糖的基本培養(yǎng)基中，在好氧和厭氧條件下的最大比生長速率為 0.23 h?1和0.18 h?1。

2.2 半纖維素酶在釀酒酵母中的表達

雖然一般的預處理手段可以水解木質纖維素中的半纖維素組分，但并不能完全水解[1]，CBP釀酒酵母依然需要高效分泌表達半纖維素酶系。迄今為止，已報道若干半纖維素酶包括 β-木聚糖酶、β-木糖苷酶等木聚糖水解酶以及其他的輔助酶和脫支酶在釀酒酵母中成功表達[51-56]。

木聚糖骨架的降解需要 β-木聚糖酶、β-木糖苷酶等木聚糖水解酶的作用，這兩種水解酶均有成功表達的報道。DC la Grange等[51]將瑞氏木霉的內切-β-1,4-木聚糖酶XYN2基因的cDNA分別在組成型強啟動子PGK1和ADH2啟動子的控制下，通過高拷貝附加體質粒，轉化釀酒酵母，產(chǎn)生的 β-木聚糖酶酶活分別為160、1 200 nkat/mL。同一課題組[52]又從短小芽胞桿菌Bacillus pumilus基因組文庫中克隆得到β-木糖苷酶基因xynB，將該基因在ADH2啟動子控制下，構建到高拷貝附加體質粒上，分別通過天然信號肽和釀酒酵母的MFα1信號肽分泌表達，結果表明只有利用MFα1信號肽的重組酵母能產(chǎn)生有生物學功能的 β-木糖苷酶，但重組酵母在合成培養(yǎng)基中生長 143 h時，β-木糖苷酶最大總酶活僅為0.09 nkat/mL。而同樣通過ADH2啟動子及MFα1信號肽的分泌表達策略，黑曲霉的 β-木糖苷酶基因xlnD在釀酒酵母中得到有活性的分泌性 β-木糖苷酶[53]。進而采用相同策略，將黑曲霉β-木糖苷酶基因xlnD及瑞氏木霉β-木聚糖酶XYN2在釀酒酵母中共分泌表達，重組酵母能產(chǎn)生酶活為1 577 nkat/mL的β-木聚糖酶和酶活為3.5 nkat/mL的β-木糖苷酶，2種酶能直接將樺木的木聚糖轉化為D-木糖[53]。

另外還需要一系列的輔助酶和脫支酶如α-D-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶以及乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶等的作用才能完全降解含多種取代基的木聚糖。Margolles-Clark等[54]在釀酒酵母中構建了瑞氏木霉的cDNA表達文庫，將此表達文庫在含有 pNPA(對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷)培養(yǎng)基的微孔平板中培養(yǎng)，有20個酵母克隆可以分泌 α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶，16個克隆的cDNA為阿拉伯糖苷酶基因ABF1，而另外4個克隆為β-木糖苷酶基因BXL1，其中表達ABF1基因的酵母能從對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷和阿拉伯糖基木聚糖中釋放 L-阿拉伯糖。Crous等[55]將黑曲霉中的α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶基因ABF B的cDNA在PGK1強啟動子的控制下，通過多拷貝質粒轉化釀酒酵母，重組酵母能分泌有活性的 α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶，在合成培養(yǎng)基和復合培養(yǎng)基上48 h產(chǎn)生的 α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶最大酶活分別為0.020 U/mL和1.40 U/mL。de Wet BJM等[56]將出芽短梗霉Aureobasidium pullulans的 α-葡萄糖醛酸苷酶的基因aguA，構建在含有ADH2強啟動子的高拷貝附加體質粒上，轉化釀酒酵母，重組酵母能產(chǎn)生有活性的α-葡萄糖醛酸苷酶。

總之，纖維素酶和半纖維素酶在釀酒酵母的成功表達，為CBP酵母菌株的選育奠定了基礎。

3 利用釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的策略

利用釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇主要從以下幾個方面加以考慮。

3.1 纖維素水解酶在釀酒酵母中的共表達

CBP酵母需要多個纖維素水解酶的活性，通過在釀酒酵母中共表達纖維素水解酶類，建立糖化及乙醇發(fā)酵系統(tǒng)，以期實現(xiàn)纖維乙醇的統(tǒng)合生物加工，人們對此進行了不懈的努力。Kotaka等[57]在釀酒酵母表面展示了米曲霉Aspergillus oryzae的β-葡萄糖苷酶基因 AO090009000356和內切葡聚糖酶基因AO090010000314，重組酵母能以20 g/L β-葡聚糖作為底物進行乙醇發(fā)酵，在 24 h內乙醇的濃度達到7.94 g/L，乙醇的轉化率達到理論值的69.6%。Fujita等[23]成功地將瑞氏木霉的EG II基因、CBH II基因和棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的BGL1基因在釀酒酵母表面實現(xiàn)共表達，重組菌株能夠直接利用磷酸膨脹纖維素(PASC)產(chǎn)生乙醇。Den Haan等[58]將瑞氏木霉的EG I基因和扣囊復膜酵母菌的BGL1基因，在釀酒酵母中共表達，重組菌株在厭氧條件下能在含10 g/L PASC為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，比生長速率為0.03 h?1，細胞濃度達到0.27 g DCW/L，同時產(chǎn)生1.0 g/L乙醇。DC la Grange等[53]將黑曲霉的 β-木糖苷酶基因xlnD和瑞氏木霉的 β-木聚糖酶的基因XYN2在釀酒酵母中共分泌表達，重組酵母產(chǎn)生的β-木聚糖酶和β-木糖苷酶能直接將樺木的木聚糖轉化為D-木糖。

3.2 強化釀酒酵母外源蛋白表達能力

由于釀酒酵母表達系統(tǒng)有一定的局限性，其缺乏有效的分泌系統(tǒng)，分泌效率低，而且容易產(chǎn)生高甘露糖型的過度N-糖基化現(xiàn)象，制約著纖維素水解酶的高效表達，有必要對纖維水解酶基因及釀酒酵母受體菌的改造方面進行改造，在不影響其他優(yōu)良特性的基礎上提高釀酒酵母菌株的外源蛋白表達能力。

3.3 纖維素水解酶釀酒酵母異源表達與相應酶系的配合

我們認為木質纖維素乙醇的統(tǒng)合生物加工過程實質上是通過一種微生物將纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和乙醇發(fā)酵過程組合或部分組合，在釀酒酵母中共表達CBP酵母所需要的所有外源基因是不太容易實現(xiàn)的，而且不僅會增加細胞的負擔，且釀酒酵母代謝己糖和戊糖的能力也有可能受到影響。如果根據(jù)特定微生物產(chǎn)生纖維素酶系的某些不足，如瑞氏木霉 β-葡萄糖苷酶的酶活較低等，將不足組分酶的基因在釀酒酵母中高效表達，配合使用相應的酶系的酶制劑，也是釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的一個策略，能在一定程度上減少成本。如Shen等[15]將扣囊腹膜酵母菌來源的BGL1基因在釀酒酵母工業(yè)菌株中成功表達，在SSF過程中，在同一纖維素酶系JU-A10的作用系統(tǒng)中，重組菌株NAN-227的纖維二糖利用能力和從微晶纖維素的乙醇產(chǎn)生速率、得率，均優(yōu)于出發(fā)菌株NAN-27與額外添加β-葡萄糖苷酶的實驗組。

3.4 纖維素水解酶各組分的比例

纖維素水解酶各組分的比例對木質纖維素的酶解作用有很大影響。Gao等[59]測定了真菌和細菌的纖維素水解酶混合物作用于氨氣爆破法(AFEX)處理的玉米秸稈的酶活，發(fā)現(xiàn)某些真菌纖維素水解酶和細菌纖維素水解酶可以協(xié)同作用于葡聚糖和木聚糖，通過測定73個不同的酶混合物組合最終確定了單個酶的最佳比例，即真菌纖維素酶(占總蛋白的78%)中CBH I占總酶的9%～51%、CBH II占總酶的9%～51%、EG I占總酶的10%～50%，半纖維素酶中(占總蛋白的22%)中LX1細菌內切木聚糖酶占總酶的13%、細菌β-葡萄糖苷酶LβX占總酶的9%；在50℃，pH 4.5條件下，酶混合物最有效，氨氣爆破法(AFEX)處理的玉米秸稈的糖化作用最佳，接近95%的葡聚糖和75%的木聚糖轉化。針對不同木質纖維素材料不同預處理方法獲得的酶解底物，確定酶解過程需要的最佳纖維素水解酶組分的比例，不僅可以在一定程度上降低成本，避免不必要的浪費，而且可以有效地提高酶解的效率，這也是統(tǒng)合加工纖維素乙醇的重要內容。

4 其他CBP載體的研究進展

其他細菌和真菌如熱纖梭菌Clostridium thermocellum、克雷伯氏桿菌Klebsiella oxytoca、運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis、瑞氏木霉及粗糙脈孢菌Neurospora crassa等均有作為統(tǒng)合生物加工的載體的研究報道。

熱纖梭菌Clostridium thermocellum由于其表面存在多個纖維素酶的蛋白質復合體——纖維小體，能直接將纖維素分解為乙醇，但其具有發(fā)酵不完全、發(fā)酵速度慢、乙醇產(chǎn)率較低等缺陷。Guedon等[60]通過途經(jīng)代謝工程手段強化了下游代謝途徑，即在熱纖梭菌中異源表達了運動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因PDC和乙醇脫氫酶基因ADH II，與出發(fā)菌株相比，重組菌株細胞濃度增加了 180%，纖維素消耗增加了 150%，乙酸和乙醇得率分別增加了93%和53%，H2得率則增加了75%。

克雷伯氏桿菌Klebsiella oxytoca是一種腸道細菌，具有較寬的底物利用范圍如已糖、戊糖、纖維二糖和纖維三糖等，特別是對纖維二糖的利用特點可減少纖維素酶的使用。但野生型的K.oxytoca發(fā)酵產(chǎn)物主要為有機酸，乙醇產(chǎn)率較低。Ingram等[61]將歐文氏菌Erwinia chrysanthemi的2種內切葡聚糖酶基因celY和celZ整合在K.oxytocaP2菌的染色體上，重組菌株分泌產(chǎn)生約20 U/mL的內切葡聚糖酶到胞外，但利用該菌配合真菌纖維素酶發(fā)酵，纖維素產(chǎn)生的乙醇卻增加了22%。

運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis是唯一通過 ED途徑厭氧發(fā)酵葡萄糖的微生物，可以發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖等六碳糖產(chǎn)乙醇，但不能利用五碳糖生產(chǎn)乙醇。運動發(fā)酵單胞菌具有較高的糖吸收率、較高的乙醇產(chǎn)率、生物量少、較高的乙醇耐受力等。但該菌底物利用范圍過窄，一般野生型Z.mobilis菌株只能以葡萄糖、果糖和蔗糖作為生產(chǎn)乙醇的底物，不能將復雜的碳水化合物代謝為乙醇。Brestic-Goachet等[62]將歐文氏菌的內切葡聚糖酶的基因celZ在運動發(fā)酵單胞菌中表達，大部分重組內切酶在胞質空間中積累。Okamoto 等[63]將醋酸桿菌Acetobacter xylinum的具有羧甲基纖維素酶(CMCase)活性的基因ACM1，構建到運動發(fā)酵單胞菌和大腸桿菌的穿梭質粒 pZA22上，重組質粒pZAAC21轉化運動發(fā)酵單胞菌和大腸桿菌，在運動發(fā)酵單胞菌中的CMC酶活比在大腸桿菌中高10多倍，但75%的總CMC酶活同樣在運動發(fā)酵單胞菌的胞質空間中被檢測到。該菌株沒有在發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇方面作過嘗試。

瑞氏木霉和粗糙脈孢菌不僅能夠高產(chǎn)量地產(chǎn)生多種糖化酶[64]，能有效地降解木質纖維素，而且同時具有轉化葡萄糖和木糖產(chǎn)生乙醇的完整代謝途徑，但是其發(fā)酵速率較慢，產(chǎn)乙醇的速率和得率不高，對乙醇的耐受性也有限，同時酶產(chǎn)生的好氧及乙醇產(chǎn)生的厭氧要求的矛盾等等，制約了其作為CBP載體的發(fā)展[21]。同樣地，粗糙脈孢菌也同時具有纖維素降解及乙醇發(fā)酵能力，而且其木糖產(chǎn)乙醇的能力較瑞氏木霉稍強[65]，但其作為CBP載體的不足之處也與瑞氏木霉相似。

5 展望

統(tǒng)合生物加工(CBP)由于其工藝上的高度整合，有效節(jié)省了原料和時間，迎合了未來生物質能源生產(chǎn)發(fā)展的趨勢，雖然構建完美CBP酵母目前來說還不太現(xiàn)實，但隨著纖維素水解酶在釀酒酵母中的表達研究的不斷進步，利用釀酒酵母生產(chǎn)纖維素乙醇的成本會進一步降低，有關CBP酵母選育方面的研究還有很長的路要走。

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Progress and strategies on bioethanol production from lignocellulose by consolidated bioprocessing(CBP)using Saccharomyces cerevisiae

Lili Xu, Yu Shen, and Xiaoming Bao
State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China

Received:July 4, 2010;Accepted:July 13, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA05Z402), International Scientific Cooperation and Exchange Special Program of China(No.S2010GR0740), National Natural Science Foundation of China(No.30970091).

Corresponding author:Xiaoming Bao.Tel/Fax: +86-531-88365826; E-mail: bxm@sdu.edu.cn國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2007AA05Z402)，國際科技合作與交流專項(No.S2010GR0740)，國家自然科學基金(No.30970091)資助。