孫迪文

新輔助化療后乳腺癌組織中survivin表達情況與腫瘤細胞凋亡、增殖的關系及其對乳腺癌化療敏感性和療效預測的臨床意義，目前報道較少[1]。

本研究應用免疫組化SABC法，檢測60例術前行新輔助化療及60例術前未行新輔助化療的乳腺癌組織中survivin和Ki-67的表達情況，同時采用TUNEL法檢測凋亡細胞，從不同層面對新輔助化療后乳腺癌組織的變化進行全面觀察，旨在探討其相關性和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取我院2003年3月～2005年6月收治臨床資料完整術前行新輔助化療的60例乳腺癌石蠟包埋標本作為研究對象，以同期60例術前未行新輔助化療的病例作為對照組。全部病例均為浸潤性乳腺癌，其中包括浸潤性特殊癌4例(乳頭狀癌2例、髓樣癌1例、黏液腺癌1例)和浸潤性非特殊癌56例(浸潤性導管癌45例、浸潤性小葉癌7例、髓樣癌1例、硬癌2例、單純癌1例)；均行改良根治術。60例新輔助化療組患者化療前均經(jīng)粗針穿刺細胞學檢查證實為乳腺癌，均為女性，年齡34～69歲，平均年齡46.2歲，中位年齡45歲。TNM分期：Ⅱb期21例；Ⅲa期25例；Ⅲb期14例。對照組60例患者，均女性，年齡32～70歲，平均年齡47.3歲，中位年齡46歲。TNM分期：Ⅱb期23例；Ⅲa期24例；Ⅲb期13例。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組織化學 標本均經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)組織脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE和免疫組織化學染色。采用SABC免疫組織化學方法(鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物 SABC)檢測survivin和Ki-67的表達。嚴格按照試劑盒說明要求進行操作，一抗稀釋度1∶100，微波修復抗原，DAB顯色，蘇木精復染。用已知陽性切片作為陽性對照(survivin陽性對照片為結腸癌，Ki-67陽性對照片為皮膚切片)，PBS代替一抗作為陰性對照。兔抗人PTEN多克隆抗體(即用型 1∶100)和兔抗人VEGF抗體(即用型 1∶100)均購自Santa Gruz公司，即用型SABC試劑合和DAB染色試劑購自武漢博士德試劑公司。

1.2.2 細胞凋亡 采用原位細胞末端轉移標記法(TUNEL法)測定細胞凋亡，嚴格按照試劑盒說明要求進行操作，用DAB顯色，用已送的陽性片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判斷

1.3.1 化療后癌組織病理形態(tài)學改變及化療療效判定標準 化療療效評定標準分為三級[2]：Ⅰ級為完全緩解(相當于臨床的cCR)，即腫瘤原發(fā)灶消失，完全被纖維組織取代(Ⅰa級)或肉眼無腫塊，僅在顯微鏡下看到少量殘存的癌細胞(Ⅰb級)；Ⅱ級為部分緩解(相當于臨床的cPR，見圖1)，既原發(fā)灶>60%腫瘤細胞出現(xiàn)變形或壞死(Ⅱa級)或原發(fā)灶20%～60%腫瘤細胞出現(xiàn)變形或壞死(Ⅱb級)；Ⅲ級為無效(相當于臨床的NC)，既原發(fā)灶<20%腫瘤細胞有輕度的變形、壞死或者沒有明顯的變化。CR+PR為總有效率。

1.3.2 免疫組化結果判斷標準 survivin免疫組化陽性產物呈棕黃色細顆粒狀，主要定位于細胞胞質內，部分胞膜表達。Ki-67免疫組化陽性產物呈棕黃色顆粒狀，定位于細胞核內。采用半定量積分法[2]，將染色強度分為3級：無著色記1分，淺著色記2分，棕黃色記3分；按陽性腫瘤細胞的百分比分3級：≤25%為一級記1分，26%～75%為二級記2分，≥76%為三級記3分。每張切片最后的得分為兩次評分的乘積(1～9)，≥3分為陽性，≤3分為陰性。

1.3.3 細胞凋亡指數(shù)(AI)的測定 采用TUNEL法，檢測細胞凋亡指數(shù)細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。每張切片在400倍鏡下隨機選擇10個視野，每個視野記數(shù)100個腫瘤細胞，共記數(shù)1000個腫瘤細胞。凋亡細胞所占腫瘤細胞總數(shù)的百分率即凋亡指數(shù)[AI=凋亡細胞數(shù)/腫瘤細胞總數(shù)(1000)×100%]。

1.4 化療方法

新輔助化療組60例患者，術前均應用CTF方案化療2個周期，化療結束后兩周行改良根治術。CTF方案：吡柔吡星(THP)500 mg/m2，第1天靜脈推注；環(huán)磷酰胺(CTX)600 mg/m2，第1、8天靜脈推注；5-氟脲嘧啶(5-Fu)500 mg/m2，第1、8天靜脈滴注；28天為1個周期。對照組60例患者，術前未行化療。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P<0.05認為差別有統(tǒng)計學意義。組間比較，采用χ2檢驗和t檢驗，survivin和Ki-67及 AI之間的關系用線性相關分析。

2 結 果

2.1 乳腺癌組織中survivin和Ki-67的表達情況

新輔助化療組survivin陽性表達率為36.7%(22/60)，明顯低于對照組(71.7%，43/60 )(χ2=14.821，P<0.01)。新輔助化療組Ki-67陽性表達率為38.3% (23/60)，明顯低于對照組(61.7%，37/60；χ2=6.533，P<0.05)。

2.2 乳腺癌組織中細胞凋亡情況

正常乳腺組織、腫瘤組織及間質內均出現(xiàn)TUNEL檢測陽性的凋亡細胞，但在腫瘤壞死周圍的凋亡細胞明顯增多。新輔助化療組AI平均為(9.34±3.12)%；對照組AI平均為(5.27±3.16)%，t=1.998，P<0.05。

2.3 新輔助化療后病理形態(tài)學改變及其與survivin表達的相關性

60例新輔助化療患者中完全緩解(pCR)為0例，44例部分緩解(pPR)，16例無變化(NC)，新輔助化療總有效率為73.3%(44/60)。新輔助化療后病理形態(tài)學改變Ⅱ級病例的survivin陽性表達率(18.2%，8/44)，明顯低于Ⅲ級病例(81.3%，13/16)(χ2=20.514，P<0.001)。

2.4 survivin表達與Ki-67表達及AI的關系

survivin和AI之間的相關系數(shù)γ=-0.36(P<0.05)，survivin表達與Ki-67表達的相關系數(shù)γ=+0.47(P<0.05)。說明survivin表達與癌細胞的AI呈負相關，而與Ki-67表達呈正相關。

3 討論

研究表明，乳腺癌具有易發(fā)生血道轉移的生物學特征，在全部初診乳腺癌患者中，有半數(shù)以上已發(fā)生血道轉移[3，4]。因此，新輔助化療已成為乳腺癌綜合治療的重要組成部分。

為了提高新輔助化療后腫瘤的緩解效果，目前，新輔助化療多采用聯(lián)合化療方案。大量臨床研究顯示，CTF方案是目前經(jīng)典的乳腺癌化療方案之一，治療乳腺癌緩解率高，而脫發(fā)和心臟毒性明顯降低，更適合長期、系統(tǒng)的化療。本研究采用該方案對60例乳腺癌患者進行新輔助化療，均能良好耐受，未發(fā)生嚴重并發(fā)癥，總有效率達73.3%，進一步說明CTF方案新輔助化療療效好。

survivin是凋亡抑制蛋白(IPA)家族的新成員，具有抑制細胞凋亡和調節(jié)細胞分裂的雙功能蛋白，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子。Survivin在多種腫瘤等增殖細胞中有不同程度表達[3～5]。Satoh研究發(fā)現(xiàn)[4]，胰腺癌survivin陽性表達率76.9%，survivin表達上調與AI有關。本研究發(fā)現(xiàn)survivin表達水平新輔助化療組顯著低于對照組，而在新輔助化療組其表達水平與化療后病理形態(tài)學改變分級密切相關，其在術前化療后部分緩解(Ⅱ級)病例的表達水平顯著低于無效者(Ⅲ級)，提示術前CTF方案化療可部分抑制乳腺癌細胞survivin的表達，這可能是新輔助化療抑制腫瘤的機制之一。

通過誘導腫瘤細胞凋亡是抑制腫瘤發(fā)展的重要手段，大多數(shù)的化療藥物都是通過誘導細胞凋亡消除腫瘤細胞[3～5]。Davis等[5]報道，對乳腺癌采用docetaxel聯(lián)合doxorubicin新輔助化療的病例，在化療前和化療后24、48 h分別取腫瘤組織測定腫瘤細胞凋亡水平變化顯示，化療后48 h測得的細胞凋亡水平值最高，化療病理反應與細胞凋亡程度呈明顯正相關。本研究顯示，新輔助化療組較對照組腫瘤細胞的AI明顯提高(9.34% v 5.27%)，從而提示有效的新輔助化療可促進乳腺癌的凋亡。

通過誘導降低腫瘤細胞的增殖能力是抑制腫瘤發(fā)展的另一重要手段。Ki-67抗原是目前公認的1種與細胞增殖密切相關的蛋白，其表達與細胞周期密切相關，它在G1后期開始出現(xiàn)，在S期和G2期逐漸升高，M期達到高峰，有絲分裂后逐漸降解消失，半衰期僅為1h甚至更短，且不表達于DNA修復狀態(tài)的細胞，因此能準確地反映腫瘤細胞的增殖活性，并與多種腫瘤的發(fā)展、轉移及預后有關[6]。Parton等[6]發(fā)現(xiàn)，化療藥物作用于乳腺癌細胞24 h以后，Ki-67水平顯著降低。本研究顯示新輔助化療組患者腫瘤細胞的Ki-67陽性表達率明顯低于對照組，從而提示新輔助化療可使腫瘤細胞增殖能力降低，細胞活性下降。

我們分析了survivin表達與AI值的關系，發(fā)現(xiàn)survivin表達水平與癌細胞凋亡指數(shù)呈負相關，說明survivin的異常表達對細胞凋亡起一定抑制作用。Yu等[7]在對胃癌和Satoh等[4]對胰腺癌的研究中都證實了這一點。Tanaka等[1]采用免疫組織化學染色檢測了167例乳腺癌組織中survivin表達，陽性率為70.7%，且survivin表達與AI有明顯的相關性。

我們也分析了survivin表達與Ki-67的關系，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關，說明survivin不僅參與了凋亡調控，還促進了細胞增殖。Survivin促進細胞增殖的機制可能為survivin蛋白通過競爭性地與周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)的復合物(主要為CyclinD-CDK4)結合，使得細胞蛋白依賴性蛋白激酶抑制蛋白(CKI 如P21蛋白)從上述復合物中釋放出來，解除了DNA復制依賴因子—Ki-67的抑制，增強了CDK的活性，從而使G1→S期促進細胞增殖。

[1] 王衛(wèi)東.凋亡抑制因子Survivin的研究進展〔J〕.國外醫(yī)學-腫瘤學分冊，2002，28(4):250.

[2] 劉 巍，張祥宏，張志剛，等.CAF方案新輔助化療對乳腺癌組織BCSG1蛋白表達的影響〔J〕.中國腫瘤臨床，2005，32(6):301.

[3] Depowsski PL，Rosenthal SI，Ross JS.Loss of expression of the PTEN gene protein product is associated with poor outcome in breast cancer〔J〕.Mod Pathol，2001，14(4):672.

[4] Satoh K，Kaneko K，Hirota M，et al.Expression of surviving correlated with cancer cell apoptosis and is involved in the development of human pancreatic duct celltumors〔J〕.Cancer，20001，92(2):271.

[5] Davis DW，Buchholz TAA，Hess KR，et al.Automated q-uantification of apoptisis after neo-adjuvant chemotherapy for breast cancer:early assessment predicts clinical response〔J〕.Clin Cancer Res，2003，9 (3):955.

[6] Parton RJ，Makris A，Davies C，et al.Vascular endothelial growth factor fails to predict response to neoadjuvant chemoheropy for primary breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2002，76 (suppyl 1):122.

[7] Yu J,Kuwabara Y,Mitanim ET AL.Expression of surviving in gastric cancer: correlation with the prognosis and response to chemotherapy〔J〕.Int J Cancer, 2001,95(2):92.