劉 偉 王學(xué)春

(泰山醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 泰安 271000)

細(xì)胞增殖和凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡決定了多細(xì)胞生物體細(xì)胞數(shù)量，平衡的破壞可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)是抑制細(xì)胞凋亡的重要成分。Survivin和Livin作為IAP成員，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。近年來(lái)人們對(duì)其結(jié)構(gòu)、分布、表達(dá)及其與腫瘤的關(guān)系做了大量的研究。CPP32(caspase-3)是凋亡執(zhí)行中的關(guān)鍵效應(yīng)酶。本文對(duì)Survivin、Livin、CPP32蛋白與腫瘤相關(guān)性的研究進(jìn)展綜述如下。

1 凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)

凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是高度保守的內(nèi)源性抗凋亡基因家族的表達(dá)產(chǎn)物，腫瘤的發(fā)生與其過(guò)度表達(dá)具有密切的關(guān)系。IAP的抗凋亡作用主要通過(guò)抑制caspase的活化而達(dá)到凋亡抑制作用[1]，目前人類(lèi)IAP已發(fā)現(xiàn)有8個(gè)成員，即NAIP，IAP(ILP-1/MIHA)，cIAP-1(HIAP-2/MI-HB)，cIAP-2(HIAP-1/MIHC)，survivin (TIAP)，apollon(Bruce)，ILP-2(Ts-IAP)和Livin(ML-IAP/KIAP)[2]。IAP主要有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：BIR、RING與CARD結(jié)構(gòu)域[3]。①BIR結(jié)構(gòu)域，即桿狀病毒IAP重復(fù)序列區(qū)(baculovirus IAP repeat， BIR)，位于N端，由含有2個(gè)或3個(gè)串聯(lián)的Cys/His的氨基酸殘基在內(nèi)的約70個(gè)氨基酸組成，具有高度的保守性[4]。IAP蛋白一般包含1～3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是IAP家族抑制細(xì)胞凋亡的功能區(qū)域。②RING結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)位于IAP COOH端的鋅指樣結(jié)構(gòu)單元，它們存在于大多數(shù)IAP家族成員之中。③CARDs(Caspase srecruitment domains)結(jié)構(gòu)域,位于IAPs分子的BIR區(qū)與鋅指結(jié)構(gòu)之間的一系列序列。至今發(fā)現(xiàn)人類(lèi)中僅cIAP1和cIAP2蛋白具有此結(jié)構(gòu)，其功能尚不清楚。所有的IAP家族成員都包含BIR結(jié)構(gòu)，所有的IAP家族成員都包含BIR結(jié)構(gòu)，其余兩個(gè)結(jié)構(gòu)并非必需[5]。

2 凋亡抑制基因Survivin、Livin

2.1 Survivin、Livin的結(jié)構(gòu)和定位

Survivin是由Ambrosini等[6]于1997年發(fā)現(xiàn)，定位于人類(lèi)染色體17q25,靠近端粒, 全長(zhǎng)15 kb,含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。Survivin的N端只含有一個(gè)保守的BIR結(jié)構(gòu)域,無(wú)TATA啟動(dòng)子和GC富集區(qū),其COOH端也無(wú)IAP家族特有的C端鋅指結(jié)構(gòu),而是有一個(gè)獨(dú)特的α-螺旋結(jié)構(gòu),富含疏水基團(tuán),能與紡錘體微管上的微管蛋白結(jié)合,作用于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能結(jié)構(gòu)域,抑制細(xì)胞凋亡。

Livin是國(guó)外學(xué)者于2000年在人類(lèi)基因組cDNA文庫(kù)中克隆得到，定位于染色體20q13, 全長(zhǎng)為4.6kb，包含7個(gè)外顯子。Livin同樣含有IAPs家族成員特有的BIR和RING結(jié)構(gòu)域。Livin BIR功能區(qū)是其發(fā)揮抗凋亡活性的必需結(jié)構(gòu)，可與caspase結(jié)合。RING結(jié)構(gòu)域不參與抑制細(xì)胞凋亡的作用，但對(duì)Livin在細(xì)胞內(nèi)的合理分布及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要的作用。

2.2 Survivin、Livin的分布與表達(dá)

Survivin的組織分布特征具有明顯的細(xì)胞選擇性，主要表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織,不見(jiàn)終末分化的成人組織(除胸腺和生殖腺外), 而在人類(lèi)大多數(shù)腫瘤組織Survivin的表達(dá)特異性增高,且在不同細(xì)胞系中其表達(dá)量和亞細(xì)胞定位不同[7-8]，推測(cè)在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中,Survivin存在的位置不同對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡作用機(jī)制有可能不同。

Livin在正常成人的大多數(shù)組織中(除胎盤(pán)外)均不表達(dá),表皮、淋巴、脾臟和黑色素細(xì)胞表達(dá)很低,在胎兒發(fā)育過(guò)程中高表達(dá),如胎兒的腦、胸腺和肝[9]。Livin在細(xì)胞中定位尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，有學(xué)者[1,9-11]認(rèn)為L(zhǎng)ivin主要表達(dá)于胞質(zhì)。但Kasof等[9]認(rèn)為L(zhǎng)ivin既在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)同時(shí)也表達(dá)于胞核。Vucic等[12]對(duì)乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)Livin在細(xì)胞中主要表達(dá)于胞質(zhì)。

2.3 Survivin、Livin的抗凋亡作用與機(jī)制

Survivin是目前已知作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，能以特征性的結(jié)構(gòu)直接或間接抑制caspase依賴或caspase不依賴的凋亡途徑，有效地對(duì)抗細(xì)胞的凋亡過(guò)程。其機(jī)制主要有:①Survivin通過(guò)阻斷由Caspase-9介導(dǎo)、細(xì)胞色素C參與的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)即內(nèi)源性凋亡途徑,間接抑制Caspase-3的活化,抑制細(xì)胞的凋亡；②抑制由Fas/Caspase-8誘導(dǎo)的Caspase活化和凋亡,即Survivin可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性,使其不能有效地水解微管結(jié)構(gòu)蛋白,維持了紡錘體的完整性,從而阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程；③Survivin可與輔助性線粒體源性caspase激活因子(second mitochondria-derived activator of caspase,SMAC)結(jié)合,進(jìn)而抑制caspase活性；④Survivin通過(guò)非Caspase依賴細(xì)胞凋亡的途徑,如參與調(diào)節(jié)p53依賴的凋亡[13],干擾p53的功能進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡；⑤Survivin還可通過(guò)對(duì)鈁錘體微管的作用調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的過(guò)程, 通過(guò)促進(jìn)姐妹染色單體精確分離和穩(wěn)定有絲分裂晚期微管結(jié)構(gòu)而維持了紡錘體的完整性,間接促進(jìn)了細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞的凋亡[14]。

目前對(duì)Livin抗細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制了解的并不多，Livin需通過(guò)一系列的凋亡刺激物的作用來(lái)表現(xiàn)凋亡的抑制，其抑制凋亡的機(jī)制主要有:①抗死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，Vucic等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Livin對(duì)Fas，TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1)，DR4(death receptor 4)及DR5(death receptor 5)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。在Fas/caspase-8誘導(dǎo)的死亡受體途徑中，Livin不直接結(jié)合caspase-8，而是直接抑制核心蛋白酶caspase-3，從而抑制整條途徑發(fā)揮抗凋亡途徑[15]；②抗線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，Livin可與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng)caspase,即激活形式的caspase-3,7,9結(jié)合，使級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的caspase間的相互作用和核酸的裂解受到抑制，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖[16]；③抗化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Livin基因的MCF7細(xì)胞可有效對(duì)抗阿霉素、4-TBP(4-tertiary butylphenol)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。

2.4 Survivin、Livin與腫瘤

2.4.1Survivin、Livin在腫瘤中的表達(dá)

凋亡抑制是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)普遍特性，Survivin和Livin作為IAP家族的成員正日益受到人們的關(guān)注。腫瘤細(xì)胞中凋亡抑制基因的高表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞凋亡,逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和清除[17]。大量研究表明，Survivin 和Livin在人類(lèi)多種類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。王小娟等[18]采用免疫組化SP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Survivin在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為80%；秦建偉等[19]采用RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中Survivin陽(yáng)性表達(dá)率為87.2%，癌旁組織為46.2%；李美玲等[20]采用免疫組化SP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳癌組Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率為67.9 %；在對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，Livin羥基末端的RING結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而定位在細(xì)胞骨架，使Livin BIR功能區(qū)能夠有效地抑制Fas、TNFR1、DR4、DR5引起的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[10]；周晟等[21]采用RT-PCR和免疫組化的方法證實(shí)，Livin mRNA和蛋白在乳腺癌腫瘤組織中含量顯著高于癌旁非腫瘤組織。

2.4.2Survivin、Livin與腫瘤的治療

目前針對(duì)腫瘤的治療，除了傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療和化療外，腫瘤的綜合治療特別是基因治療和免疫治療為腫瘤的治療提供了新途徑，能夠增加對(duì)凋亡的抵抗是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特點(diǎn)。在腫瘤的治療中如何抑制特殊的抗凋亡因子的作用將會(huì)給我們提供一個(gè)合理的新的治療策略。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)證明，在多種腫瘤中IAP的過(guò)表達(dá)與化療耐藥有關(guān)，認(rèn)為化療中如果藥物能夠干預(yù)IAP將會(huì)起到更好的療效[22]。

在基因治療方面，RNA干擾技術(shù)和反義核苷酸技術(shù)被用來(lái)干擾Survivin 和Livin的基因表達(dá)，用于增加腫瘤細(xì)胞凋亡的易感性。用Survivin反義核苷酸轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞, Survivin mRNA和蛋白表達(dá)量降低，呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性[23]，細(xì)胞生長(zhǎng)受限及凋亡指數(shù)增加；Crnkovic等[24]使用具有靶向作用的小干涉型RNA(siRNA)干涉腫瘤細(xì)胞內(nèi)生性Livin基因的表達(dá)，使Livin基因沉默而不表達(dá)蛋白，腫瘤細(xì)胞在使用阿霉素、紫外線照射以及TNF-α等凋亡促進(jìn)劑治療后，凋亡率大大增加。由此推論，Survivin 和Livin基因可能成為腫瘤治療上有前途的分子靶點(diǎn)。

在免疫治療方面，Xiang等[25]構(gòu)建了Survivin的DNA口服疫苗，用于肺癌小鼠動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)出高度活性樹(shù)突狀細(xì)胞(DC),產(chǎn)生有效的特異性CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)抗體內(nèi)Survivin抗原,抑制新生血管的生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,消除或抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移；Mads等[26]發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Livin作為一種腫瘤抗原物質(zhì)，在外周血中會(huì)產(chǎn)生特異性地識(shí)別Livin的抗體，在浸潤(rùn)于腫瘤中針對(duì)Livin的反應(yīng)性T細(xì)胞表面包被HLA-A24(human leucocyte antigen-A24)抗原復(fù)合體，它對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，因此預(yù)示Livin可作為免疫干涉的適當(dāng)靶點(diǎn)。

3 凋亡調(diào)控基因Survivin、Livin與CPP32

3.1 CPP32基因

哺乳動(dòng)物的細(xì)胞凋亡由天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族介導(dǎo)[27]。研究[28]表明，多種基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，而caspase蛋白的表達(dá)是各種細(xì)胞凋亡機(jī)制的最后共同通路。CPP32,又稱半胱氨酸蛋白酶32(cysteine protease P32，caspase-3)，是caspase家族中與凋亡關(guān)系最密切的成員，大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素最終均需通過(guò)CPP32介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Neill等[29]發(fā)現(xiàn)，在良性前列腺增生中CPP32表達(dá)明顯高于前列腺惡性腫瘤，并且存在著自發(fā)凋亡，從而推論CPP32作為凋亡的核心成分之一在腫瘤的自發(fā)凋亡中發(fā)揮著重要的作用?？梢?jiàn)，CPP32在腫瘤中的表達(dá)具有重要的意義。

3.2 Survivin、Livin與CPP32的關(guān)系

在腫瘤細(xì)胞中Survivin和Livin基因均與CPP32基因協(xié)同發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。推測(cè)其機(jī)制如下：(1)Survivin通過(guò)阻斷由Caspase-9介導(dǎo)、細(xì)胞色素C參與的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)即內(nèi)源性凋亡途徑,間接抑制Caspase-3的活化,抑制細(xì)胞的凋亡；(2) Survivin抑制由Fas/Caspase-8誘導(dǎo)的Caspase活化和凋亡,即Survivin可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性,使其不能有效地水解微管結(jié)構(gòu)蛋白,維持了紡錘體的完整性,從而阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程；(3)Livin主要通過(guò)抑制凋亡終末效應(yīng)酶caspase的活性發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的作用[11]。Livin能夠直接抑制caspase-3,7,9的水解作用，其BIR結(jié)構(gòu)域能夠和caspase結(jié)合并抑制caspase的功能。Livin還能夠在凋亡起始點(diǎn)直接干擾Procaspase-9或caspase-9的活性，削弱caspase的活化，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生。

Survivin基因、Livin基因、CPP32基因均為凋亡相關(guān)基因，Survivin基因和Livin基因抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而CPP32則可誘導(dǎo)凋亡。這些基因的異常表達(dá)或突變影響到凋亡的發(fā)生，從而可使惡性變的細(xì)胞繼續(xù)存活，為細(xì)胞的DNA進(jìn)一步損傷或突變提供條件。

4 展 望

腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡失衡所致，受體內(nèi)外多重因素調(diào)控。目前腫瘤治療兩個(gè)最大的問(wèn)題為放化療對(duì)正常細(xì)胞具有毒性作用和腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生抗性。誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的腫瘤基因治療是提高治療效果的一條重要的途徑。Survivin和Livin作為IAP家族成員，其確切的抗細(xì)胞凋亡作用已得到證實(shí)。因此，研究Survivin和Livin的作用機(jī)制可以為掌握腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后提供重要的理論依據(jù)，Survivin和Livin有望成為腫瘤的標(biāo)志物，可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，為腫瘤的診斷治療開(kāi)辟一條新途徑。但是目前對(duì)Survivin和Livin的研究?jī)H僅停留在實(shí)驗(yàn)階段，且大都是體外實(shí)驗(yàn)，還有待進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。相信對(duì)Survivin和Livin的更深入的研究能夠?yàn)槟[瘤的治療提供行之有效的新途徑。

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