方 濤,初向陽

(解放軍總醫(yī)院胸外科,北京,100853)

根據WHO統(tǒng)計,肺癌已經成為全球男性和女性的第一癌癥殺手,造成了沉重的社會負擔。肺癌也是我國發(fā)病率最高的癌癥,年發(fā)病率為35/10萬人。早期肺癌往往缺乏明顯癥狀,60%～85%非小細胞肺癌患者無法進行根治性切除,使用常規(guī)化療只能略微改善癥狀而無法獲得長期療效。吉非替尼(Gefitinib)起初作為表皮生長因子受體(EGFR)阻滯劑用于化療難治性非小細胞肺癌(NSCLC)患者的姑息治療,它對一小部分NSCLC患者有快速、顯著的療效。進一步研究發(fā)現,這些患者絕大部分存在內皮生長因子(EGF)基因突變[1]。有關EGFR突變與腫瘤發(fā)生以及EGFR突變在分子靶向治療中的作用日益受到人們的關注?，F就EGFR突變在肺癌發(fā)生中的分子機制及分子靶向治療的臨床研究近況進行介紹。

1 內皮生長因子受體(EGFR)

內皮生長因子受體(EGFR)是一種蛋白酪氨酸激酶受體(RTK),位于第7號染色體p13～q22區(qū),全長200 kb,由28個外顯子組成,編碼1186個氨基酸[2],其糖蛋白分子量約l70 kDa[3],廣泛分布于除成熟骨骼肌細胞、體壁內胚層和造血組織以外的所有組織細胞。EGFR家族有4個結構相似的受體分子:ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4),同屬于受體酪氨酸激酶(RTKS)。它們都含有1個胞外配體結合結構域,1個跨膜結構域和1個具有酪氨酸激酶活性的胞漿結構域。其胞內區(qū)域與erbB癌基因產物高度同源[4]。

EGFR的活化可以通過配體誘導的受體二聚化作用實現。ErbB受體家族中,除了HER2外,其他成員都有其相應配體,各種各樣的配體是由對應的跨膜蛋白前體經過蛋白水解而來的,都有1個EGF樣結構域。與EGFR特異性結合的配體包括表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子α(TGFα)、雙向調節(jié)蛋白(AR)、β-細胞素(BTC)、肝素結合EGF樣生長因子(HB-EGF)、表皮調節(jié)素(EPR)等[5]。

胞外配體EGF(內皮生長因子)與ErbB2特異性結合后引起ErbB2構型改變,導致受體二聚化從而活化它們的胞漿位點。ErbB2的胞內區(qū)域酪氨酸磷酸化后進而活化第二信使轉導,通過MAPK(絲裂原蛋白激酶)途徑誘導細胞外信號的活化(調節(jié)激酶Erkl和 Erl):通過PDK(磷脂酰肌醇激酶)途徑活化信號轉導子JAK;進一步啟動STAT1、STATS3的轉錄活化子;另一方面,細胞內信號通過Grb2(生長因子受體結合蛋白)活化下游的ERK(細胞外調節(jié)蛋白激酶),進而介導ATF,NF-κ B,Ap-1,c-fos和 c-Jun的轉錄活化。這些都是EGFR所介導的生長作用或致癌的基本下游途徑。

異常的EGFR活化機制包括受體本身的擴增、受體配體的過表達、活化突變以及負性調節(jié)途徑的缺乏,因此EGFR誘導癌癥至少通過3種機制:EGFR配體的過表達,EGFR的擴增或EGFR的突變活化[6]。在這3種機制中,EGFR的突變活化是導致腫瘤細胞異常生物學行為的最主要因素。

EGFR基因的某些突變會導致受體效果增強和持續(xù)時間的延長。Lynch等證明變異受體并不影響受體蛋白質的穩(wěn)定性,通過Tyr1068磷酸化測定EGFR活化發(fā)現,野生型受體的活化15 min即下調,而變異受體表現出比正常EGFR高2倍的效應,且超過3 h的持續(xù)活化[7]。

2 EGFR突變與TKI的治療效果

EGFR突變并沒有影響腫瘤細胞與TKI(酪氨酸激酶抑制劑)結合的能力。TKI對那些因突變而導致EGFR活化的原因可以通過oncogene addiction模型來解釋。通過 Ras.Raf-MEK.ERK1/ERK2、PI3K.Akt、STAT3/STAT5 通路,EGFR突變高度激活下游信號,啟動EGFR調節(jié)抗凋亡和生存信號,導致癌癥細胞變得依賴此信號以維持其生存——即具有癌基因(突變的EGFR)依賴的特征;當使用特異性 TKI阻斷EGFR信號后,將消除其增殖性影響和輸出生存信號,導致腫瘤細胞死亡。因此認為,癌癥細胞中信號轉導通路的變異是出現藥物高敏感的基礎。相反,正常細胞或非EGFR依賴的腫瘤細胞(對Gefitinib、Erlotinib無反應)不受影響。因為生存還受其他基因驅使,或者在EGFR抑制后能被其他的RTK所彌補。

在癌基因依賴模型中,細胞癌癥依賴的癌基因可以同時產生凋亡和生存2個信號的輸出。一般情況下,癌基因被激活。生存信號占主導地位,而凋亡信號處于相對低水平,使癌癥細胞維持生長和增殖。當癌基因急性失活后,在關鍵的窗口期,首先是生存迅速大幅度減弱。而凋亡信號緩慢下降。因此導致信號不平衡(凋亡信號占主導),啟動細胞發(fā)生不可逆的凋亡[8]。

研究發(fā)現用酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼(gefitinib)/厄洛替尼(Erlotinib)治療NSCLC患者,大約 10%患者表現出迅速而滿意的臨床效果,進一步研究發(fā)現這些患者絕大部分存在EGFR基因突變。在目前已知與 EGFR-TKI(內皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑)有關的基因突變局限于如下幾種:G719X(18外顯子),E746-A450缺失(19外顯子),L858R(21外顯子),L861Q(21外顯子),T790M(20外顯子)和D770-N771(20外顯子)。其中E746-A450缺失和L858R的突變與TKI的療效高度相關。

Mitsudomi T,Yatabe Y對568例非小細胞肺癌患者的分析結果:在所有非小細胞肺癌患者中大約90%的EGFR基因突變集中于19或21外顯子中,其中19外顯子的缺失突變及21外顯子中的點突變的患者服用EGFR-TKI的有效率均達到70%以上[9]。

近來的研究提示,EGFR外顯子20的插入性突變(D770-N771)可以使受體對 EGFRTKI的敏感性降低100倍,臨床上也發(fā)現具有此突變的患者對EGFR-TKI治療反應不明顯[10]。

對外顯子20的擴增產物進行亞克隆分析發(fā)現,T790M突變是一個堿基對發(fā)生從胞嘧啶核苷(C)到胸腺嘧啶核苷(T)的改變,在蛋白水平就是EGFR酪氨酸激酶功能域790位點的蘇氨酸被蛋氨酸取代(T790M),這種突變可使EGFR重新處于被激活狀態(tài),從而導致TKI的獲得性耐藥,耐藥的原因是突變導致EGFR結構發(fā)生變化,使TKI與其結合出現位阻效應[11]。為了進一步證實第二種突變導致患者對Gefitinib耐藥,Kobayashi S等進行了體外試驗,研究者將構建的T790M突變片斷轉染到體外培養(yǎng)的腫瘤細胞中,用不同濃度的Gefitinib(從0～2 mol/L)處理轉染的細胞,然后采用Western-blotting方法,檢測磷酸化EGFR的表達情況。結果證實發(fā)生T790M突變的細胞對Gefitinib耐藥[12]。

KRAS是EGFR下游的關鍵調節(jié)分子。15%-30%的NSCLC存在KRAS密碼子12和13突變,與患者的預后差相關。有研究提示KRAS突變可能是Gefitinib、Erlotinib原發(fā)耐藥的原因。Helena linardou的Meta分析中總結了1008例NSCLC患者的TKI治療效果,在發(fā)生K-ras突變的165名患者中,94%的患者對TKI治療無明顯反應[13]。

一般來講,KRAS和 EGFR突變NSCLC是相互排斥的.在不同的腫瘤亞型中存在明顯差異:EGFR突變主要見于不吸煙者,而KRAS突變更常見于吸煙相關的癌癥。因為KRAS突變總是發(fā)生于具有野生型EGFR的NSCLC中,所以難以區(qū)分對EGFR—TKI不敏感到底是因為KRAS突變,還是因為無EGFR突變。

3 EGFR突變與臨床相關因素

目前的研究表明EGFR突變與性別、種族、吸煙、病理類型有關,在東方人群、女性、非吸煙、腺癌的患者中變異發(fā)生率較高[14-16]。

Haneda研究了112例手術治療的腺癌患者,年齡范圍為38～82歲,平均年齡64.3歲,包括70名男性和42名女性,其中男性中非吸煙者49名(44%),吸煙者11名(15%),女性中非吸煙者38名(90%),在112例患者中發(fā)現發(fā)現48例患者病理為腺癌合并細支氣管肺泡癌成分(包括腺癌合并細支氣管肺泡癌成分和細支氣管肺泡癌),其中28例存在EGFR突變,其他的64例患者中有24例存在EGFR突變,統(tǒng)計學分析表明EGFR突變與腺癌合并細支氣管肺泡癌成分相關(P=0.0358)。Haneda還分析了性別和吸煙的影響,認為在病理類型為腺癌合并細支氣管肺泡癌成分的男性患者中具有較高的EGFR突變率(P=0.0135),就整個患者群體而言,非吸煙患者較吸煙患者有較高的EGFR突變率(P=0.001),但在女性人群中,是否吸煙與EGFR突變無明顯關聯(P=0.999)[17]。

Yano[18]觀察了32名具有EGFR突變的腺癌患者與48例無EGFR突變的患者的薄層掃描CT對比,分析了腫瘤直徑、毛玻璃征比例、胸膜切跡、邊緣毛刺、血管聚集與EGFR突變的關系,發(fā)現在女性患者中,腫瘤直徑<3 cm,毛玻璃征比例>50%,有較高的EGFR突變率(11/12),但由于病例數少,尚有待證實。

Haneda[19]收集了95例直徑小于2 cm的周圍型腺癌標本,將標本分為2組,一組以腫瘤生長取代正常的肺泡細胞并有不同程度的肺纖維化為病理特征,另一組為肺泡細胞正常生長,沒有破壞性生長,發(fā)現在前者(47.1%)中較后者中(16%)更易發(fā)現EGFR突變。

綜上所述,東方人群、女性、非吸煙、腺癌與EGFR突變相關,在近期研究發(fā)現腺癌中含細支氣管肺泡癌成分、腫瘤直徑、影像表現毛玻璃征等也可以作為存在EGFR突變的依據。

4 EGFR的檢測方法

4.1 DNA測序法

基因測序是檢測基因突變的標準與可靠的方法。但過程較復雜:獲取腫瘤組織、分離腫瘤細胞、提取核酸和進行測序,所需時間長,費用高,對取材和技術要求都比較嚴格,因此應用于臨床仍受到一定程度的限制。在中國有基因公司專門提供EGFR基因突變的檢測,盡管避免了操作的限制和縮短了成果的時間,但費用昂貴。

4.2 PCR-酶切法

PCR(聚合酶鏈式反應)是進行核酸擴增的有效方法。該方法基于已知的突變類型設計相應的引物,然后根據PCR產物的性質(有無或大小)來判斷特異性突變的存在。該方法分為兩步進行,首先利用限制性內切酶去選擇性消化野生型的EGFR基因片斷,從而使反應體系中突變型EGFR基因片斷得到富集,再通過PCR放大和凝膠電泳來進行突變的判斷。該法降低了對檢測組織的要求,大大地提高了突變檢測的靈敏度。PCR-酶切法無需測序,但只能針對已知的突變位點設計特異引物進行檢測[20]。

4.3 PCR-SSCP

PCR-SSCP(聚合酶鏈式反應一單鏈構象多態(tài)性)是一種經典的檢測基因突變的方法,原理為:單鏈DNA由于有鏈內堿基配對而具有一定的空間構象,當DNA鏈上的堿基發(fā)生改變時,單鏈DNA會形成不同的構象,即單鏈構象多態(tài)性。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中,不同構象的DNA分子具有不同的泳動速度。單鏈DNA分子的相對遷移率不僅與DNA分子的大小有關,而且與其構象有關。與測序法比較,該方法敏感性高,可以發(fā)現測序未能發(fā)現的突變。但PCRSSCP也有它固有的局限性,電泳時間較長,操作步驟比較繁瑣,且只能進行定性的分析。

4.4 ScorpionsARMS

Scorpions ARMS(蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng))使用熒光標記的Scorpion引物進行PCR Scorpion引物含有一個特殊的探針序列,5′和3′端由互補的序列形成一個發(fā)夾環(huán)結構,從而在不同的擴增位點中止復制。大量終止于不同擴增位點的熒光引物經過電泳和分析后可以快速的得出結論。與直接測序法相比,ARMS法特異性接近,而敏感性更高,但該方法尚未獲得批準進入臨床,目前僅有少數研究機構可以進行。

綜觀以上所有方法,目前直接測序法仍是突變檢測的金標準。相對于DNA測序法,其它分子生物學方法各有其優(yōu)缺點,臨床上亟待一種簡便、快速、準確和經濟的肺癌EGFR基因突變檢測方法的出現,為肺癌個體化治療服務,為肺癌病人造福。筆者認為ARMS法進入臨床后會有較好的應用前景。

5 近期大規(guī)模臨床試驗結果

5.1 IPASS實驗

IPASS(Iressa Pan-Asia Study):一項評價吉非替尼(易瑞沙)(250 mg片劑)對比卡鉑紫杉醇雙藥化療一線治療臨床選擇的亞洲晚期(ⅢB或Ⅳ期)非小細胞肺癌(NSCLC)的療效、安全性和耐受性的開放、隨機、平行、多中心、Ⅲ期臨床研究。

對于有EGFR突變的患者,吉非替尼組的PFS明顯優(yōu)于化療組,相反,對于沒有EGFR突變的患者,化療組的PFS明顯優(yōu)于吉非替尼組;從有效率上看,沒有EGFR突變的患者接受吉非替尼治療的有效率竟然低至1.1%,不僅低于有EGFR突變患者接受吉非替尼治療的71.2%,也顯著低于化療組的47.3%和23.5%。

結果表明:只有選擇 EGFR基因突變的患者,行一線吉非替尼靶向治療,才可能實現真正的個體化治療;若對患者不加選擇地使用EGFR-TKI,則EGFR突變陰性的患者生存期明顯縮短。

5.2 SATURN實驗

Cappuzzo報告的SATURN研究的數據,1949例晚期NSCLC患者接受了含鉑兩藥化療方案;889例患者在治療后疾病無進展。收集這些患者的腫瘤組織,并根據EGFR表達、分期(ⅢB、Ⅳ期)、PS評分、化療方案和吸煙史進行分層。患者隨機分配至厄洛替尼組或安慰劑組接受治療,直至疾病進展。

厄洛替尼組的PFS率顯著高于安慰劑組(HR=0.71,95%CI 0.62～0.82,P=0.000003),而免疫組化EGFR陽性患者中該HR為0.69,其疾病進展風險降低29%～31%,PFS延長41%～45%。厄洛替尼治療的有效率為40.8%,而安慰劑組僅為27.4%(P<0.0001)。

厄洛替尼組的毒性反應較小,患者可耐受。且亞組分析顯示,對于各人群(無論性別、PS評分、EGFR表達和種族),厄洛替尼均顯示有效。

5.3 META分析

Shepherd等對 INTEREST、V-15-32、SIGN和ISTANA這4項研究中的2257例患者進行了Meta分析,分析顯示吉非替尼治療者的OS和PFS與多西他賽治療者相似,而ORR優(yōu)于后者;在亞裔人群中,兩組的OS相似,但PFS(P<0.05)和ORR(P<0.001)均優(yōu)于多西他賽組。研究者認為,與多西他賽相比,吉非替尼療效略佳,毒副反應小,患者生活質量(QOL)較高,且其口服方便,因此,無論亞裔抑或廣泛人群都可能從中獲益。

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