桑 丹 孫海洲* 趙存發(fā) 郭俊清

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所,呼和浩特 010030;2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,呼和浩特 010031; 3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院,呼和浩特 010018）

畜牧生產(chǎn)的目的是提供肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品,以滿(mǎn)足人類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)的需求。如何提高動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)合成量和飼料中蛋白質(zhì)的利用效率,為人類(lèi)提供更加安全、健康的食品,是近年來(lái)反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)研究,特別是分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)興起以來(lái)的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。近年來(lái),隨著氨基酸營(yíng)養(yǎng)組學(xué)的興起,研究者們提出了功能性氨基酸的概念。功能性氨基酸是指除了合成蛋白質(zhì)外還具有其他特殊功能的氨基酸,其不僅對(duì)動(dòng)物的正常生長(zhǎng)及維持是必需的,而且對(duì)多種生物活性物質(zhì)的合成也是必需的。此類(lèi)氨基酸包括精氨酸、谷氨酰胺、支鏈氨基酸（branched-chain am ino acids,BCAAs）、色氨酸、甘氨酸和脯氨酸等[1]。BCAAs包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸,是唯一一類(lèi)調(diào)控肝外代謝的必需氨基酸。它們主要在骨骼肌代謝,約占骨骼肌蛋白質(zhì)必需氨基酸的35%,同骨骼肌的合成有著密切的關(guān)系[2]。早期研究表明BCAAs在調(diào)節(jié)骨骼肌中蛋白質(zhì)合成具有重要作用[3]。亮氨酸是動(dòng)物體內(nèi)唯一的生酮氨基酸,它是BCAAs中對(duì)蛋白質(zhì)代謝起主要調(diào)節(jié)作用的氨基酸。近年來(lái)有研究進(jìn)一步證實(shí),BCAAs中的亮氨酸在刺激肌肉內(nèi)部蛋白質(zhì)合成是最有效的,而異亮氨酸和纈氨酸要差一些[4]。有研究報(bào)道,亮氨酸增加蛋白質(zhì)合成高達(dá)50%,而抑制分解僅為25%[5]。抑制分解的主要是亮氨酸分解代謝產(chǎn)物α-酮異己酸的作用。

功能性氨基酸具有特殊的營(yíng)養(yǎng)功能,補(bǔ)充功能性氨基酸在增強(qiáng)機(jī)體能量代謝、增強(qiáng)免疫能力、延遲中樞疲勞、促進(jìn)肌肉合成、加快機(jī)體恢復(fù)等方面具有一定的功效。為此,本試驗(yàn)根據(jù)代謝動(dòng)力學(xué)原理,結(jié)合常規(guī)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究方法,采用大劑量一次性灌注法,從組織蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)入手,研究瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)綿羊機(jī)體蛋白質(zhì)合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用12只體況良好,體重為（25.00±2.86）kg的6月齡綿羊羯羊,按體重隨機(jī)分為4組,每組3只,進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧參照肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 816—2004）配制,基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。對(duì)照組試羊（1組）飼喂基礎(chǔ)飼糧,每只日喂量1.0 kg;試驗(yàn)組試羊每日每只分別補(bǔ)飼0.5（2組）、1.0（3組）和1.5 g（4組）瘤胃保護(hù)性亮氨酸。試驗(yàn)組每日基礎(chǔ)飼糧飼喂量1.0 kg,補(bǔ)飼瘤胃保護(hù)性亮氨酸混入基礎(chǔ)飼糧中喂給。試驗(yàn)期間各組試羊無(wú)剩料現(xiàn)象。瘤胃保護(hù)性亮氨酸添加量參考Flakoll等[6]。亮氨酸購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司,純度99%,包被產(chǎn)品來(lái)源于常州佳發(fā)制粒干燥設(shè)備有限公司。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Tab le 1 Com position and nutrient levels of basal diet （DM basis,%）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羊每日在06:00和18:00分別先粗后精等量飼喂2次,自由飲水。預(yù)試期15 d,飼喂基礎(chǔ)飼糧。試驗(yàn)期15 d,對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)組飼喂添加瘤胃保護(hù)性亮氨酸的飼糧。

1.4 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)采用大劑量一次灌注法,測(cè)定不同組織的蛋白質(zhì)合成率（FSR）[8]。

試驗(yàn)期結(jié)束后,在預(yù)先刮好的腹部皮膚處用普魯卡因進(jìn)行局部麻醉,用直徑1 cm的環(huán)鉆在該區(qū)域的后底緣采取2個(gè)皮膚組織樣品,用作組織的本底樣品（t0）。采下的樣品用冰生理鹽水沖洗,液氮冷凍,-80℃冷藏保存。通過(guò)綿羊一側(cè)頸靜脈插管將L-d5苯丙氨酸灌注液緩慢注入,10 m in注完。灌注劑量為按每kg BW0.75灌注0.2 gL-苯丙氨酸（L-Phe,其中含0.027 gL-d5苯丙氨酸,純度99%）。

灌注前,從另一側(cè)頸靜脈插管采取血液樣品作為0時(shí)間點(diǎn)樣品。灌注開(kāi)始后,分別在5（灌注中）、10（灌注后）、20、40、60及90m in采取血樣,每次采血5～10 m L。在冰浴中保存,然后在4℃條件下2 000×g離心15 m in,血漿樣品-20℃保存,供同位素Phe分析。在灌注開(kāi)始后90m in,迅速放血屠宰。快速采取背最長(zhǎng)肌、股二頭肌、肝臟等組織樣品,冷鹽水沖洗,液氮冷凍,-80℃保存。準(zhǔn)確記錄組織樣品的采樣時(shí)間。準(zhǔn)確記錄肌肉、肝臟和皮膚等各組織的重量。經(jīng)過(guò)前處理后[8],通過(guò)氣-質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）來(lái)測(cè)定各組織FSR及蛋白質(zhì)合成量。

1.5 計(jì)算方法

1.5.1 血漿游離氨基酸庫(kù)中示蹤氨基酸的豐度（MPEp）的計(jì)算[8]

MPEp等于90m in采樣期間各采樣點(diǎn)MPE的加權(quán)平均值。M PE0,M PE5,…,M PE90分別代表0, 5,…,90m in的MPE值。

1.5.2 各組織FSR的計(jì)算

FSR的計(jì)算根據(jù)Lobley等[9]采用的公式計(jì)算:

MPE0和MPEt分別代表0時(shí)間點(diǎn)本底樣品和90 m in采集樣品中蛋白質(zhì)結(jié)合的MPE值。

1.5.3 總蛋白質(zhì)合成量的計(jì)算

總蛋白質(zhì)合成量（g/d）=（蛋白質(zhì)含量×FSR）/100

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel軟件進(jìn)行整理,運(yùn)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析,用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)各組織FSR的影響

在本研究中,瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)骨骼肌FSR有顯著影響（P＜0.05）。如表3所示,3組股二頭肌FSR顯著高于1、2和4組（P＜0.05）;各試驗(yàn)組背最長(zhǎng)肌FSR與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）。各試驗(yàn)組肝臟FSR與對(duì)照組比較差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)綿羊機(jī)體蛋白質(zhì)合成速率的影響Table 3 Effects of the rumen-protected leucine on fractional synthesis rates of protein in sheep（%/d）

2.2 瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)各組織蛋白質(zhì)含量和合成量的影響

瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)各組織蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)表4。3組股二頭肌蛋白質(zhì)含量顯著高于其他各組（P＜0.05）,其他各組之間差異不顯著（P＞ 0.05）,以對(duì)照組蛋白質(zhì)含量最低。3組背最長(zhǎng)肌蛋白質(zhì)含量顯著高于1組和2組（P＜0.05）,4組背最長(zhǎng)肌蛋白質(zhì)含量與對(duì)照組比較顯著提高（P＜0.05）。各組肝臟蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）,其中以3組最高。

表4 瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)綿羊機(jī)體蛋白質(zhì)含量的影響Table 4 Effects o f the rumen-p rotected leucine on p rotein content in sheep（g）

瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)股二頭肌、背最長(zhǎng)肌及肝臟的蛋白質(zhì)合成量的影響見(jiàn)表5。各試驗(yàn)組股二頭肌、背最長(zhǎng)肌和肝臟的蛋白質(zhì)合成量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）,3組股二頭肌和背最長(zhǎng)肌合成量顯著高于其他各組（P＜0.05）

表5 瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)綿羊機(jī)體蛋白質(zhì)合成量的影響Table 5 Effects of the rumen-protected leucine on synthesis content of protein in sheep（g/d）

3 討 論

3.1 亮氨酸對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成的影響

傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究是利用生長(zhǎng)試驗(yàn)或氮平衡試驗(yàn)評(píng)定動(dòng)物生產(chǎn)能力和飼糧中粗蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)潛力,但是始終不能滿(mǎn)意地解釋粗蛋白質(zhì)攝入變化對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)沉淀過(guò)程變化的影響。體蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡概念提出以后,人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的中間代謝才有了比較深刻的認(rèn)識(shí)。作為認(rèn)識(shí)體蛋白質(zhì)代謝的基本理論,蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡仍然是提高動(dòng)物生產(chǎn)效率、提高飼料利用率、準(zhǔn)確評(píng)定動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要的重要研究領(lǐng)域[10]。

本試驗(yàn)從蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)入手,研究亮氨酸對(duì)綿羊機(jī)體蛋白質(zhì)合成的影響。蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)受到諸如營(yíng)養(yǎng)水平、激素、動(dòng)物生理狀態(tài)等多種因素的影響。蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)對(duì)飼糧的采食水平也非常敏感,而蛋白質(zhì)的沉積主要與飼糧的蛋白質(zhì)品質(zhì)及能量攝入有關(guān)。很多研究是針對(duì)整體蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝,而整體蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝的改變并不意味著機(jī)體的所有組成部分都同樣發(fā)生改變。

Fulks等[11]研究發(fā)現(xiàn),同其他氨基酸相比,在離體培養(yǎng)的老鼠隔膜的介質(zhì)里加入等同于其血清中濃度的BCAAs,包括亮氨酸、異亮氨酸與纈氨酸,可更有效地促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成并抑制蛋白質(zhì)的分解。而當(dāng)加入介質(zhì)里的BCAAs達(dá)到5倍于血清濃度（0.5 mmol/L亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸）時(shí),會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成并抑制其降解。此后,Buse等[12-13]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),促進(jìn)老鼠半隔膜蛋白質(zhì)的合成并抑制蛋白質(zhì)的降解的是亮氨酸而不是異亮氨酸或纈氨酸。Libby等[5]也研究表明,對(duì)蛋白質(zhì)代謝具有調(diào)節(jié)作用的支鏈氨基酸主要是亮氨酸,而異亮氨酸和纈氨酸對(duì)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成和降解影響甚小。亮氨酸可能通過(guò)其氧化脫羧反應(yīng)中支鏈含氧酸脫氫酶活性形式的改變,降低蛋白質(zhì)的降解[5]。Tischler等[14]和Li等[15]也分別證實(shí)了亮氨酸在骨骼肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝中的這種作用。在本試驗(yàn)中,瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)骨骼肌FSR有顯著影響,其對(duì)股二頭肌、背最長(zhǎng)肌的蛋白質(zhì)合成量也都有顯著影響,這與以上研究結(jié)果一致。

3.2 亮氨酸對(duì)肝臟蛋白質(zhì)合成的影響

Libby等[5]認(rèn)為,亮氨酸對(duì)肌肉中蛋白質(zhì)平衡的生理調(diào)節(jié)作用類(lèi)似胰島素,但亮氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)作用僅限于肌肉組織,對(duì)肝臟和成纖維細(xì)胞則無(wú)此效應(yīng)。Lobley等[16]研究表明,肝臟FSR對(duì)迅速變化的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)反映并不敏感,提高營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)肝臟FSR無(wú)明顯影響,但隨著營(yíng)養(yǎng)水平的提高,肝臟的重量和蛋白質(zhì)總量增加。由于FSR無(wú)變化,提高營(yíng)養(yǎng)水平時(shí)蛋白質(zhì)的沉積增加,肝臟體積增大有可能是蛋白質(zhì)降解率下降的結(jié)果[17]。H?ussinger等[18]研究表明,肝臟的蛋白質(zhì)降解可能由肝臟細(xì)胞體積變化來(lái)調(diào)節(jié),當(dāng)營(yíng)養(yǎng)素和代謝產(chǎn)物濃度和量發(fā)生變化時(shí),影響了細(xì)胞內(nèi)滲透壓,進(jìn)而使得肝臟細(xì)胞體積以及數(shù)量改變,肝重量和蛋白質(zhì)總量也發(fā)生相應(yīng)的變化。本研究中,各組肝臟蛋白質(zhì)總量差異均不顯著,可能因?yàn)闄C(jī)體可利用氨基酸數(shù)量相對(duì)較高,導(dǎo)致肝臟蛋白質(zhì)的降解速率下降,從而造成肝臟重量和蛋白質(zhì)總量的增加。

4 結(jié) 論

①瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)綿羊骨骼肌FSR的影響顯著（P＜0.05）,但對(duì)肝臟FSR則影響不顯著（P＞0.05）。

②瘤胃保護(hù)性亮氨酸對(duì)綿羊骨骼肌及肝臟組織的蛋白質(zhì)合成量顯著增加（P＜0.05）,以1.0 g/d添加量效果最好。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:sunhaizhou@china.com

（編輯 田艷明）