可溶性玉米須多糖的提取與純化

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 王在貴 劉朝良 吳曉峰 方楊武

玉米須為禾本科玉屬植物玉米（Zea mays L.）的花柱及柱頭，其味淡、性平，有清血熱、利尿等功效（南京藥學(xué)院，1980）。我國是養(yǎng)殖大國，玉米作為能量飼料在我國的種植面積逐年擴(kuò)大，其副產(chǎn)品玉米須產(chǎn)量也越來越大，因此，利用玉米須提取可溶性多糖，有利于玉米須資源的充分利用，提高經(jīng)濟(jì)效率。鄭鴻雁等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，玉米須多糖具有調(diào)節(jié)小鼠體液免疫功能和增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。目前，可溶性玉米須多糖因其具有多種生物活性而逐漸引起關(guān)注，本試驗(yàn)對產(chǎn)自安徽亳州的玉米須多糖進(jìn)行提取純化，為其實(shí)際開發(fā)與利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要設(shè)備 玉米須購自合肥市為民大藥房。

分光光度計(jì)（VIS-7220，北京瑞利分析儀器有限公司），可調(diào)恒溫水浴鍋（HH-5，江蘇國順儀器廠），高速離心機(jī)（TDL-60B，上海安言科學(xué)儀器廠），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9425A型），1/1000臺式天平（JTY-架盤藥物天平，上海醫(yī)用激光儀器廠），標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，苯酚，濃硫酸（98%分析純），95%乙醇，丙酮，乙酸乙脂等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取24只20 mL試管分為3組，編號，分別加入一定量的蒸餾水和葡萄糖溶液，然后在每只試管中加入6%的苯酚溶液1 mL，將各試管仔細(xì)搖勻后，向每試管中加入5 mL 98%濃硫酸，靜置20 min后搖勻，在40℃的恒溫水浴鍋里靜置15 min后490 nm處測定OD值。做3個平行試驗(yàn)，取平均值。計(jì)算葡萄糖濃度的線性范圍，以糖含量為橫坐標(biāo)，OD490為縱坐標(biāo)制作線性關(guān)系圖，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.003x，R2=0.999。

1.2.2 玉米須的提取過程 玉米須→烘干→研磨→微沸浸泡→過濾→濃縮→乙醇沉淀→靜置→離心→無水乙醇、丙酮、乙酸乙脂交替洗滌→乙醇沉淀→烘干→得玉米須粗成品（王在貴等，2008；金麗梅等，2007）。

具體操作：將玉米須在烘箱中50℃干燥后研磨成粉末狀保存。稱取5 g玉米須粉末于杯中，加50 mL蒸餾水置于60℃水浴鍋里浸泡2 h，用四層紗布過濾，濾液繼續(xù)在60℃水浴鍋中濃縮至16 mL，然后加入2.5倍（即40 mL）95%乙醇靜置充分沉淀8 h。用離心機(jī)5000 r/min離心5 min后棄上清液。在沉淀中加入丙酮洗滌后離心2次，然后繼續(xù)分別加入無水乙醇和乙酸乙脂洗滌后離心2次，將最后所得的沉淀放入表面皿中于50℃烘箱中烘12 h，即得到60℃條件下提取的玉米須多糖粗產(chǎn)品。

1.2.3 多糖含量的測定 具體操作：取0.025 g多糖粗制品，研磨后加少量水溶解，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中定容。取1 mL樣品液稀釋10倍（加水9 mL）再取稀釋后的樣品液2 mL于試管中，加入6%的苯酚1 mL，再加濃硫酸5 mL，靜置10 min搖勻。將上述試管放入恒溫水浴鍋中水?。?0℃），15 min后取出。在490 nm處測OD值，作3個平行，取平均值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線帶入所測光度密值換算出多糖含量（張惟杰，1987），按以下公式分別計(jì)算相關(guān)提取指標(biāo)數(shù)值。

多糖含量（μg/g）=查標(biāo)準(zhǔn)曲線（μg）×稀釋倍數(shù)/樣品的質(zhì)量（g）；

多糖提取率（%）=多糖干重（g）/玉米須干重（g）×100%；

多糖得率（%）=多糖含量（μg/g）×多糖提取率×100%。

1.2.4 多糖的初步純化 TCA法除蛋白：稱取1.5 g粗糖，加30 mL純水溶解，再分別稱取三氯乙酸0.3 g各加水10 mL配成濃度為3%的TCA溶液。分別取10 mL粗糖溶液加入上述TCA溶液中，靜置5 h后離心，分別加入無水乙醇至含醇量達(dá)80%，靜置過夜，再次離心后棄去上清液，取出沉淀50℃烘箱過夜即得初步純化的產(chǎn)品。

1.2.5 酶法助提玉米須渣中的多糖 稱取煮過的玉米須提取殘?jiān)? g（干重），取8支試管，編為1～8號加酶液，處理溫度為37℃，處理時(shí)間為180 min（魏靜娜等，2008），處理后的樣品用四層紗布過濾，其他步驟按1.2.2的方法進(jìn)行。

1.2.6 玉米須多糖的純度鑒定 提取的粗多糖用TCA法除多糖結(jié)合蛋白后，配置成0.1 mg/mL溶液用紫外掃描檢驗(yàn)TCA法除蛋白的效果，得掃描圖譜（劉春蘭等，2009）。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響多糖提取的因素

2.1.1 不同溫度對粗糖提取的影響 重復(fù)1.2.1步驟，改變玉米須多糖的提取溫度。分別在30、50、70℃和90℃條件下提取玉米須多糖粗產(chǎn)品。根據(jù)1.2.2測定不同提取溫度下所得到多糖的含量，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，在80℃時(shí)，從玉米須中提取多糖的總含量最高。

圖1 溫度對玉米須粗糖提取的影響

2.1.2 提取時(shí)間不同對粗糖提取量的影響 分別在 100 ℃水中浸泡 70、80、90 min和 100 min；用四層紗布過濾，再把所的濾液離心8 min（5000 r/min）取上清液在100℃水浴鍋中濃縮至16 mL，其他重復(fù)1.2.2步驟，根據(jù)1.2.3測定在不同提取時(shí)間下所得到多糖的含量，結(jié)果見圖2。由圖3可以看出，在80℃提取時(shí)間為80 min條件下，提取多糖得率最高。

圖2 提取時(shí)間對玉米須粗糖提取的影響

2.1.3 不同乙醇體積對粗糖提取的影響 80℃水中浸泡80 min，用四層紗布過濾，再把所得濾液離心8 min（5000 r/min）取上清液在80℃水浴鍋中濃縮至16 mL，然后向其中分別加入2、2.5（即 40 mL）、3倍，95%乙醇靜置充分沉淀 8 h。其他重復(fù)1.2.2步驟，根據(jù)1.2.3測定在不同體積的95%乙醇沉淀時(shí)所得到多糖的含量，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出：在80℃提取時(shí)間為80 min條件下，用2.5倍（40 mL）的95%乙醇沉淀時(shí)，從玉米須中提取多糖得率最高。

圖3 不同乙醇體積對玉米須多糖提取的影響

2.1.4 不同水料比對玉米須多糖得率的影響 由圖4可以看出，最佳的加水倍數(shù)為18倍。試驗(yàn)結(jié)果說明水提醇沉法提取玉米須多糖，最佳提取條件為80 min、80℃、18倍的水料比，用2.5倍體積多糖液的乙醇醇沉。

圖4 不同水料比對玉米須多糖得率的影響

2.2 TCA法除蛋白結(jié)果 結(jié)果測得未除蛋白質(zhì)前測得多糖的糖OD490為1.916，蛋白質(zhì)OD595為1.424。

從表1可以看出，當(dāng)三氯乙酸溶液濃度為3%時(shí)，多糖的損失不是很高，且蛋白除得較充分，因此，合適的TCA濃度為3%。

表1 TCA法除蛋白質(zhì)結(jié)果

2.3 酶法助提玉米須渣中的多糖結(jié)果 提取多糖后，稱出糖重量、測糖純度，結(jié)果見表2。由表2可以看出，β-葡聚糖酶用量為7 mL時(shí)，酶助提效果最好。

2.4 玉米須多糖紫外掃描結(jié)果 從圖5可以看出，在280 nm附近不存在明顯的吸收峰，說明糖結(jié)合蛋白基本除盡。

3 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)提取過程參照了王在貴等（2008）茶多糖的提取方法，通過比較發(fā)現(xiàn)水料比對玉米須多糖的提取結(jié)果影響較大。由于玉米須的胞外多糖比胞內(nèi)多糖含量多，胞內(nèi)多糖的提取率和細(xì)胞壁破碎程度有關(guān)，如果酶解細(xì)胞壁的方法充分破碎細(xì)胞，就能有效的提取胞內(nèi)多糖。紫外掃描結(jié)果在260～280 nm時(shí)曲線下降緩慢的現(xiàn)象，可能由于樣品中含有部分核酸干擾吸光度數(shù)值而導(dǎo)致曲線下降緩慢。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米須多糖提取的最佳條件為：80 min、80 ℃、18倍的水料比、2.5倍體積乙醇沉淀效果最佳；3%濃度的TCA溶液除蛋白質(zhì)效果最好；通過紫外掃描檢測純化樣品表明糖結(jié)合蛋白基本除盡。

表2 酶法助提玉米須多糖試驗(yàn)結(jié)果

圖5 玉米須多糖（0.1 mg/mL）的紫外全波段掃描

[1]金麗梅，劉偉.水提醇沉淀法玉米須多糖的提取工藝研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，19（5）：62 ～66.

[2]劉春蘭，鄧義紅，杜寧，等.新疆雪蓮水溶性多糖的分離純化及組成分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21：99 ～103.

[3]南京藥學(xué)院.中草藥學(xué)[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1980.167.

[4]王在貴，劉朝良，楊世高，等.茶多糖的提取與初步純化[J].中國飼料，2008，10：38 ～40.

[5]魏靜娜，朱宏吉，林強(qiáng).纖維素酶和超聲輔助提取玉米須多糖[J].化學(xué)工業(yè)與工程，2008，25（2）：146 ～149.

[6]張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海：上?？萍汲霭嫔?，1987.251～253.

[7]鄭鴻雁，閔偉紅，昌友權(quán)，等.玉米須多糖調(diào)節(jié)免疫功能研究[J].食品科學(xué)，2004，10：291 ～293.