薛俊龍，田林君，張國權，王國艷，張李俊，劉一飛

（山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

隨著我國規(guī)?；?、集約化養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，依靠良好的疫苗和完善的免疫程序，病毒性傳染病基本得到控制。而細菌性傳染病尤其是雞沙氏門菌?。òu白痢、雞傷寒和雞副傷寒），由于抗生素可對其進行有效防治，從而忽視了對傳染源和傳播途徑的綜合防控，加之臨床抗菌素的不合理使用日趨嚴重，其已成為目前影響?zhàn)B雞業(yè)最常見的細菌性傳染病之一[1-3]，近年來呈現(xiàn)擴大流行的趨勢。

為了解山西省雞沙門氏菌病流行情況，本試驗對相關媒介材料和有代表性的養(yǎng)雞場進行了雞沙門氏菌病病原、傳播途徑等的分離、調(diào)查、分析和研究，旨在為科學防治提供一定依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、營養(yǎng)肉湯、三糖鐵培養(yǎng)基、微量生化鑒定管，均購自杭州天和生物制品公司。BP增菌液和亞硒酸鹽增菌培養(yǎng)基（SF）基礎購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.2 雞沙門氏菌因子血清 它購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，批號為20090201。

1.1.3 藥敏紙片 恩諾沙星、氨芐青霉素、卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、頭孢噻呋、大觀霉素、復方磺胺、新霉素，購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司，批號為20090722。

1.1.4 試驗動物 1日齡蛋公雛（經(jīng)平板凝集反應檢測，雞白痢和副傷寒均為陰性的種雞蛋孵出的雛雞）購自山西省軍區(qū)種雞場。

1.1.5 菌株分離材料 山西市場上銷售的部分濃縮飼料、全價配合飼料；部分種雞場2008—2009年正值生產(chǎn)的種雞泄殖腔棉拭子；部分種雞場2008—2009年正值生產(chǎn)的種雞所產(chǎn)種蛋；部分種雞場周齡內(nèi)的父母代雛雞；部分種雞場、規(guī)?；唐冯u場雞舍地面和飼槽等環(huán)境；周齡內(nèi)疑似雞沙門氏菌病死亡的臨床病例。

1.1.6 雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原 它為北京中海動物保健科技公司生產(chǎn)，批號為200801。

1.1.7 被檢血清 選自山西省境內(nèi)7個父母代蛋種雞場，5個規(guī)?；唐返半u場。

1.2 方法

1.2.1 分離材料的采集

（1）選擇山西境內(nèi)銷售的雞用濃縮飼料和全價飼料適量，于無菌包裝袋中，盡快送往實驗室。（2）選擇山西省規(guī)?；改复N雞場，對不同批次正值生產(chǎn)的種雞，以每批10只無菌采集泄殖腔棉拭子。（3）無菌采集來自不同祖代雞場的周齡內(nèi)父母代雛雞泄殖腔棉拭子。（4）選擇有代表性的種雞場和商品蛋雞場，無菌采集雞舍地面和飼槽的樣本。具體方法是：在被選擇的雞舍地面和飼槽各選2個點，每點為5 cm×5 cm的正方形（規(guī)板），以滅菌的棉拭子蘸取BP前增菌液，在采樣點5 cm×5 cm的地面或飼槽上，滾動涂擦2次后，剪斷棉拭子手持端，使其落入試管的增菌液中[4]。（5）選擇部分種雞場的新鮮種蛋，實驗室無菌條件下取其卵黃0.5mL。（6）無菌操作采集疑似雞沙門氏菌病死亡的雛雞肝組織或膽囊，冷藏保存，3 h內(nèi)進行培養(yǎng)分離。

1.2.2 實驗室分離培養(yǎng)

（1）將1.2.1的濃縮飼料、全價飼料，泄殖腔棉拭子，地面、飼槽棉拭子，種蛋卵黃經(jīng)過24 h，37℃恒溫BP前增菌培養(yǎng)，接種于SF增菌液中24 h，無菌條件下接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。（2）將死亡雛雞的病變肝組織或膽汁，無菌條件下接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2.3 分離菌的培養(yǎng)特性 挑取SS瓊脂培養(yǎng)基上呈灰色、圓形、中心帶黑色的可疑菌落，接種于三糖鐵瓊脂斜面、營養(yǎng)肉湯等培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 分離菌的生化試驗和血清型鑒定

1.2.4.1 形態(tài)及生化試驗 按常規(guī)方法進行形態(tài)結(jié)構(gòu)與染色特性觀察；用分離菌的純培養(yǎng)物進行糖發(fā)酵試驗、靛基質(zhì)試驗等生化反應。

1.2.4.2 運動性試驗 以滅菌的接種針蘸取細菌的純培養(yǎng)物，垂直穿刺接種于半固體培養(yǎng)基的瓊脂柱內(nèi)，置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，取出觀察。運動性的細菌沿穿刺線向四周擴散生長，使培養(yǎng)基變混濁；無運動性的細菌只沿穿刺線生長，周圍的培養(yǎng)基仍保持澄清。

1.2.4.3 血清型鑒定 挑取典型三糖鐵培養(yǎng)物進行沙門氏A-F多價O診斷血清、O單因子血清玻片凝集反應，并設生理鹽水為對照進行觀察。

1.2.5 動物感染試驗 1日齡雛雞130只，隨機分為13組，第1～12組皮下接種培養(yǎng)18 h分離鑒定的沙門氏菌肉湯培養(yǎng)液0.2mL；第13組用同樣的方法接種生理鹽水作為對照。每6 h觀察發(fā)病和死亡情況，并記錄到24 h。

1.2.6 藥敏試驗 按WHO推薦的Kir-by-Baner方法進行[5]。

1.2.7 抗體檢測方法 采用平板凝集試驗，按常規(guī)方法進行[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌實驗室分離結(jié)果

2.1.1 分離菌的培養(yǎng)及形態(tài)特性 共分離培養(yǎng)雞沙門氏菌媒介材料及病理材料961羽份，詳細結(jié)果列于表1。

BP增菌液有菌株生長，一般顯示淡黃色混濁。SF增菌液有菌株生長，培養(yǎng)液多呈現(xiàn)紅色并混濁。SS瓊脂上菌落呈灰色、邊緣整齊、多數(shù)菌落的中心帶有黑色。SS瓊脂上的可疑菌落三糖鐵（TSI）瓊脂培養(yǎng)特性為：底層變?yōu)辄S色，斜面維持原有的紅色，有的菌株培養(yǎng)基中有黑色硫化氫產(chǎn)生，有的菌株培養(yǎng)基底部高層有氣泡產(chǎn)生。同時接種于營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)結(jié)果為：液體均勻混濁，不形成菌膜或菌環(huán)。半固體培養(yǎng)結(jié)果為皆無運動性。三糖鐵瓊脂細菌革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性小桿菌。

表1 沙門氏菌分離培養(yǎng)情況 羽份

2.1.2 生化鑒定 對TSI瓊脂培養(yǎng)基上符合沙門氏菌生長特征的177株菌中的91株做生化鑒定（飼料4株、環(huán)境3株、成雞拭子8株、種蛋7株、種雛拭子20株、病料49株），結(jié)果列于表2。

表2 91株分離菌生化鑒定結(jié)果

從表2可以看出，被檢菌株的生化反應結(jié)果皆符合雞白痢、雞傷寒沙門氏菌的生化特性，但其中菌株對麥芽糖、衛(wèi)矛醇、山梨醇、H2S的反應無論是同一種媒介材料和病料，還是不同的媒介材料都無規(guī)律。以菌株對麥芽糖生化反應為依據(jù)，區(qū)別雞白痢和雞傷寒沙門氏菌（即發(fā)酵麥芽糖的為雞傷寒沙門氏菌，否則為雞白痢沙門氏菌），本研究中雞白痢沙門氏菌占68.13%，雞傷寒沙門氏菌占31.87%。

表3 20株分離菌抗原血清型鑒定結(jié)果

2.1.3 血清型鑒定 將三糖鐵培養(yǎng)基上的177株菌與雞白痢、雞傷寒沙門氏菌陽性診斷血清進行玻板凝集反應，結(jié)果全部呈陽性凝集，并且大多呈強陽性凝集，鹽水對照凝集反應為陰性。對其中20株（飼料1株、環(huán)境1株、成雞拭子2株、種蛋2株、種雛拭子6株、病料8株）進行了抗原血清型分析，結(jié)果列于表3。

2.1.4 雛雞感染試驗結(jié)果 各組在皮下接種6 h后，部分雞出現(xiàn)不同程度精神萎頓、嗜睡的臨床病癥，到24 h可見部分死亡，詳細情況是：飼料組（第1，2組）3只、5只；環(huán)境組（第3，4組）4只、5只；成雞拭子組（第 5，6組）2只、4只；種蛋組（第 7，8組）5只、5只；種雛拭子組（第 9，10組）5只、7只；病料組（第11，12組）8只、9只；鹽水對照組（第13組）0只。死亡雞肝臟皆分離出了與接種菌同樣的沙門氏菌。

2.1.5 20株分離菌藥敏試驗結(jié)果 由表4可知，分離的20株雞沙門氏菌，對阿米卡星和頭孢噻呋的敏感率為100%；對卡那霉素、大觀霉素、新霉素、萬古霉素的敏感率為70%～90%；對氨芐青霉素的耐藥率為70%；對復方磺胺的耐藥率為90%。

2.2 規(guī)?；u場污染情況調(diào)查結(jié)果

2.2.1 7個種雞場血清學調(diào)查結(jié)果 表5顯示，被調(diào)查的山西省7個具有代表性種雞場的37 554只在最佳的檢測日齡，雞白痢、雞傷寒檢出陽性數(shù)為962只，占被檢數(shù)的2.6%。種雞場檢出陽性率最高的為47.8%，最低的為0.2%。

表4 20株分離菌對12種抗生素敏感性測定結(jié)果

表5 種雞場血清學調(diào)查結(jié)果

2.2.2 11個雞場商品蛋雞血清學調(diào)查結(jié)果 表6顯示，11個被調(diào)查的商品蛋雞場，在最佳的檢測日齡，2 441只被檢雞中雞白痢、雞傷寒陽性數(shù)為396只，占被檢數(shù)的15%。商品蛋雞場檢出陽性率最高的為35%，最低的為10%。

表6 商品蛋雞血清學調(diào)查結(jié)果

3 小結(jié)與討論

（1）雞沙門氏菌?。òu白痢、雞傷寒和雞副傷寒3種?。┮恢笔请u的重要傳染病。本研究通過對雞沙門氏菌可能存在的媒介材料進行分離和鑒定，結(jié)果表明，被分離的媒介材料中皆有雞沙門氏菌病病原菌的存在，主要以雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌為主，血清型為09和012。這為從生物安全技術方面有效控制該病提供了科學依據(jù)。

（2）媒介材料中3日齡內(nèi)的父母代種雞泄殖腔分離陽性率為20%，這應該是雞沙門氏菌病傳入山西省并造成蔓延的重要原因。提醒廣大養(yǎng)殖者選擇無雞沙門菌病的祖代或父母代種雞場引進雛雞；父母代雞場應切實做好雞白痢和雞傷寒的臨床凈化工作。

（3）父母代種蛋的分離陽性率為15%，飼料中致病菌的分離率約為5%，環(huán)境中為1.9%；病雞的陽性率為81%，成年雞肛拭陽性率為5.7%，這些媒介是沙門氏菌病在山西省水平傳播的重要因素之一。應加強飼料原料中病原菌的控制，嚴格雞舍的消毒、病死雞的無害化處理以及加強亞健康雞的預防和治療。

（4）雞沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生和致病性大腸桿菌一致，不僅是由長期的某種藥物選擇壓力所致，而且更多的情況是來源于細菌間耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移及多重耐藥性的影響，且隨著孵化雛雞而遷移[7-8]。因此，根據(jù)試驗結(jié)果，在科學用藥的前提下，今后相當長的時間內(nèi)，防治雞沙門氏菌病可首選阿米卡星、頭孢噻呋、新霉素、萬古霉素等抗生素，盡可能避免使用耐藥率較高的復方磺胺、氨芐青霉素等；恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素等應通過藥敏試驗來選擇使用。

（5）本試驗調(diào)查的種雞場和商品蛋雞場涉及山西省的運城市、臨汾市、長治市、呂梁市、太原市、晉中市、忻州市養(yǎng)雞業(yè)較發(fā)達的地區(qū)，結(jié)果可以代表山西省的普遍狀況，共檢測父母代種雞37 554羽份，平均陽性率為2.6%，最高達到47.8%，母雞陽性率最高24%，雖然低于毗鄰的內(nèi)蒙古自治區(qū)的平均陽性率13.6%，最高92.31%[9]，但也遠高于國家規(guī)定的種雞場雞白痢和雞傷寒陽性率0.2%的標準，說明山西省的雞白痢、雞傷寒的感染率也處于較高的水平，種雞場污染嚴重。所以，種雞場雞沙門氏菌病的凈化迫在眉睫。調(diào)查顯示，商品雞的陽性率明顯高于種雞，平均為15%。究其原因，經(jīng)種雞場的垂直傳播是關鍵，最根本的是商品雞飼養(yǎng)者對沙門氏菌病的防控意識不強，獸醫(yī)衛(wèi)生、防治措施不力。

［1］ 周廷宣.后備種雞血清中沙門氏菌病抗體的檢測 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2007（34）：87.

［2］ 王貴升，田夫林，陳靜，等.山東省規(guī)模養(yǎng)殖場沙門氏菌流行病學調(diào)查分析[J].家禽科學，2007（5）：11-13.

［3］ 方平，楊永莉，楊寶，等.Real-time PCR方法檢測肉品中的沙門氏菌[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2010，38（8）：71-76.

［4］ 傅先強，劉占軍.養(yǎng)禽場禽病檢驗手冊[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，1992.

［5］ 馬興樹.禽傳染病實驗診斷技術[M].北京：化學工業(yè)出版社，2006：108-109.

［6］ 程安春，汪銘書，汪開毓，等.現(xiàn)代禽病診斷和防治全書[M].成都：四川大學出版社，1997：89-90.

［7］ 劉業(yè)兵，張文龍，潘志明，等.陜西關中地區(qū)雞白痢沙門氏菌的藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，1999（2）：7-9.

［8］ 張秀珍.當代細菌檢驗與臨床[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：343-345.

［9］ 申之義，李利萍，張慶華，等.內(nèi)蒙古地區(qū)雞沙門氏菌病流行病學調(diào)查[J].中國家禽，2000（10）：33-34.