劉小健 周士福 周洪偉 時(shí)偉峰 戴啟明 孫春雷 孟 東

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,保乳手術(shù)已成為歐美國家治療早期乳腺癌的主要方法之一 ,術(shù)后全乳放射治療是目前早期乳腺癌保乳手術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)治療[1,2],但是Vicini等研究結(jié)果表明保乳患者術(shù)后全乳照射不一定是必要的,采用電子射線的術(shù)中放療(21 Gy)原則上可以替代保乳術(shù)后的外部放療。同時(shí) Barbara等[3]研究表明,保乳患者術(shù)中放療后 24 h內(nèi)傷口引流液作為乳腺癌細(xì)胞生長的 1個(gè)微環(huán)境,對乳腺癌細(xì)胞的增殖、生長、運(yùn)動有著一定的影響。本課題即對引流液內(nèi)的生長相關(guān)性癌基因(growth-regulated oncogene-1,GRO-1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量的變化做一研究,并分析兩者的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2007年 6月至 2009年 9月我院乳腺中心收治的60例乳腺癌保乳手術(shù)患者,均為女性,年齡 35～50歲,平均 42.60歲,將 60例保乳患者隨機(jī)分為兩組,每組 30例。其中一組為對照組:單純行保乳手術(shù);另一組為試驗(yàn)組:行保乳手術(shù)并輔以術(shù)中電子射線照射。試驗(yàn)組患者具體操作過程如下:所有行術(shù)中電子射線患者采用硬膜外連續(xù)麻醉,以便患者配合,同時(shí)照射過程中麻醉醫(yī)生通過加速器室內(nèi)攝像系統(tǒng)監(jiān)察患者。直線加速器室術(shù)前 1天用紫外線照射滅菌。手術(shù)者在專用手術(shù)室內(nèi)將圓形鉛板置乳房后間隙,絲線縫合乳腺,再進(jìn)一步游離乳腺淺面以便限光筒的放入,準(zhǔn)備工作完善后,將患者及麻醉監(jiān)護(hù)裝置推至隔壁加速器室,使用 Varian Clinic 23EX直線加速器,根據(jù)腫瘤大小及部位選擇平面或斜面相應(yīng)直徑的限光筒(均為無菌狀態(tài)),應(yīng)用限光筒后,加速器的電子線百分度劑量(percent depth dose,PDD)會有變化,根據(jù)我院實(shí)際測量的數(shù)據(jù),為保證靶區(qū)乳腺表面達(dá)到 90%以上的處方劑量,我們應(yīng)用 2～5mm的生理鹽水紗布作為組織等效填充物,放置在照射的乳腺表面。通過皮膚切口置入限光筒,皮膚及皮下脂肪位于限光筒外,在加速器工作人員的配合下固定限光筒裝置后,選擇 9Mev電子線,靶區(qū)處方劑量為 21 Gy,單次照射,時(shí)間約為 2～3 min。

1.2 標(biāo)本采集

所有保乳患者切口處均放置潘氏引流管以方便引流液采集。待術(shù)后24 h用 20ml無菌針筒從潘氏引流管內(nèi)抽取引流液,然后將引流液放置蘇州大學(xué)附屬第四醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室無菌離心管內(nèi),離心機(jī) 2 000轉(zhuǎn)/分,離心 10 min后取上清液,并將上清液存放至-70℃冰箱中,待實(shí)驗(yàn)前半小時(shí)取出恢復(fù)至常溫。

1.3 試劑與儀器

人 GRO-1和人 VEGF的 ELISA試劑盒購自美國ADL公司,酶標(biāo)儀由蘇州大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科提供檢測。

1.4 方法和步驟

操作方法及步驟嚴(yán)格按照人 GRO-1和人 VEGF試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、2次溫育及洗滌、顯色等一系列步驟后,在 450 nm波長下依次測定各孔的吸光度(OD值)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GRO-1標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合圖及擬合方程

擬合方程:y=a+bx2+cx3+dx4+ex5(a=0.37123274,b=-054.453956,c=1942.2459,d=-4465.7715,e=3088.8425)

GRO-1標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合圖見圖 1。

圖1 GRO-1標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合圖

根據(jù)上述曲線方程計(jì)算出兩組患者 24 h傷口引流液內(nèi) GRO-1含量,對照組和試驗(yàn)組GRO-1含量分別為(50.08±14.09)pmol/l和 (15.64±2.80)pmol/l,兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 VEGF標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合圖及擬合方程

擬合方程:y=a/(1+be-cx)(a=1850.0786,b=20.691958,c=6.9705137)

VEGF標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合圖見圖 2。

圖2 VEGF標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合圖

根據(jù)上述曲線方程計(jì)算出兩組患者 24 h傷口引流液內(nèi) VEGF的含量分別為(427.16±20.18)ng/l和(206.55±6.34)ng/l,兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 GRO-1表達(dá)與 VEGF表達(dá)的關(guān)系

對照組患者引流液內(nèi) GRO-1和 VEGF的含量分別為(50.08±14.09)pmol/l和(427.16±20.18)ng/l,兩者表達(dá)呈正相關(guān)性(γ=0.817,P＜0.01);試驗(yàn)組患者引流液內(nèi) GRO-1和 VEGF的含量分別為(15.64±2.80)pmol/l和(206.55±6.34)ng/l,兩者表達(dá)也呈正相關(guān)性(γ=0.449,P＜0.05)。

3 討論

Paget等[4,5]首次提出了“種子和土壤”理論假設(shè),“種子”我們可以認(rèn)為就是術(shù)后瘤床內(nèi)的殘瘤細(xì)胞,“土壤”即為術(shù)后的瘤床。目前保乳手術(shù)術(shù)后的復(fù)發(fā)灶大部分局限在手術(shù)切口瘢痕處,這一現(xiàn)象最常見的解釋是切口內(nèi)殘余腫瘤細(xì)胞的存在[3],也即所謂“種子”的殘留,但是其中微環(huán)境成分的作用也是 1個(gè)不容忽視的因素。從哲學(xué)的角度來看,“種子”的存在可以認(rèn)為是乳腺癌局部復(fù)發(fā)這一事件的內(nèi)因,而“土壤”——“瘤床”內(nèi)成分的改變即為外因,內(nèi)因和外因共同作用加速事件的發(fā)生、發(fā)展。但是我們可以干擾其中的外因以此來抑制保乳手術(shù)患者局部復(fù)發(fā)這一事件的發(fā)展——ELIOT。

從國外的數(shù)據(jù)來看,2001年倫敦大學(xué)醫(yī)學(xué)院 25名接受術(shù)中放療患者的隨訪結(jié)果(中位隨訪 2年)表明,該組患者無明顯并發(fā)癥及無局部復(fù)發(fā)[6],2008年意大利米蘭歐洲腫瘤研究所公布了其 1999年 7月至2006年 12月經(jīng)術(shù)中放療治療的 1246例(未進(jìn)入隨機(jī)試驗(yàn))原發(fā)性乳腺腫瘤患者研究結(jié)果[7],隨訪 0.3～94.7個(gè)月(中位隨訪 26個(gè)月),24例(1.9%)局部復(fù)發(fā),與常規(guī)全乳放療局部復(fù)發(fā)率相近,不高于常規(guī)全乳放療患者。這些研究結(jié)果表明了經(jīng)過術(shù)中放療后,保乳患者局部的復(fù)發(fā)率控制效果取得了標(biāo)準(zhǔn)化術(shù)后全乳放射治療一樣的效果。

所以我們通過本次實(shí)驗(yàn),對其中微環(huán)境內(nèi)成分的變化做一研究,以期望提供 1個(gè)新的理論依據(jù)來解釋為何也能起到和全乳放射治療一樣的局部復(fù)發(fā)控制效果。從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看,行 ELIOT的保乳患者“土壤”內(nèi)的 GRO-1和 VEGF這兩者的含量發(fā)生了明顯的改變,其中可能的機(jī)制有:一是手術(shù)本來切除了腫瘤從而減少了腫瘤對 GRO-1和 VEGF的分泌;二是經(jīng)過術(shù)中電子射線照射,破壞了 GRO-1和 VEGF的蛋白結(jié)構(gòu);從而減少了滲液內(nèi) GRO-1和 VEGF的含量,而 GRO-1和 VEGF這兩者與腫瘤的生長、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等有著密切聯(lián)系的。

GRO-1也稱 GRO-α,系統(tǒng)命名為 CXCL1,過去曾被稱為 MGSA(melanomagrowth stimulatory activity),對應(yīng)于小鼠為 KC或 MIP-2(macrophage inflame matory protein一 2)基因。GRO家族是一類屬于 ELR-CXC族的趨化因子,除了 GRO-α外,還包括 GRO-β,GRO-γ(即 GRO-1,GRO-2,GRO– 3),GRO-α,GRO-β,GRO-γ相互比鄰,緊密連鎖。GRO家族在惡性腫瘤演進(jìn)中的作用越來越受到重視。Folkman的研究表明腫瘤是典型的血管依賴性病變,缺乏血管形成時(shí)腫瘤生長受限[8]。而 GRO-1作為 GRO家族中重要的一員,除了能自分泌作用促進(jìn)細(xì)胞生長除了能自分泌作用促進(jìn)細(xì)胞生長,還能通過旁分泌作用促進(jìn)腫瘤中新生血管的生長和轉(zhuǎn)移[9],同時(shí) GRO-1還有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用[10]、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用[11]。

VEGF是腫瘤內(nèi)血管生長的促進(jìn)因子,它們過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及治療密切相關(guān),是近年來發(fā)現(xiàn)的 1種內(nèi)皮細(xì)胞分裂素,也是 1種糖蛋白,VEGF是以同源聚體的方式存在,其分子量為 34～45 kD。VEGF能夠特異性地與內(nèi)皮細(xì)胞表面的Ⅲ型酪氨酸激酶受體Flt1和 KDR/Flk1結(jié)合,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖并增加血管通透性,并上調(diào) Bcl-2基因表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和生長。因此,VEGF高表達(dá)對癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移有明顯的促進(jìn)作用[12]。

在本次試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),經(jīng)過過術(shù)中放療后的傷口引流夜內(nèi)的 GRO-1含量與 VEGF的含量明顯低于術(shù)后放療組內(nèi)的含量,因此,我們可以認(rèn)為,經(jīng)過術(shù)中放療以后的保乳患者瘤床內(nèi)的成分發(fā)生了相應(yīng)的改變,即所謂的“土壤”發(fā)生了一定的改變,而“土壤”內(nèi)GRO-1含量的降低可以減慢腫瘤細(xì)胞的新生血管的形成、阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖作用及侵襲轉(zhuǎn)移作用,VEGF含量的減少可以相應(yīng)減弱 Bcl-2基因的表達(dá),阻止腫瘤細(xì)胞增殖、生長及轉(zhuǎn)移作用。從對照組上看,GRO-1和 VEGF在表達(dá)上均呈正相關(guān)性,其中比較重要的原因是 GRO-1在腫瘤發(fā)生中的新生的形成呈劑量關(guān)系,并且在腫瘤發(fā)展中可以通過增強(qiáng) VEGF促進(jìn)血管化作用[13]。而通過術(shù)中電子射線照射后,GRO-1量的減少對腫瘤血管形成及轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用也相應(yīng)減輕,從而進(jìn)一步可以減輕 VEGF促進(jìn)血管化的作用,使得原來有助于腫瘤在局部形成的“土壤”變成 1個(gè)不利用“種子”復(fù)發(fā)的微環(huán)境。同時(shí) GRO-1和 VEGF在這一微環(huán)境內(nèi)的表達(dá)量均有所明顯下降,并且兩者之間的表達(dá)也呈相關(guān)性,一方的減少也引起了另一方的減少,兩者同時(shí)的表達(dá)下調(diào)使得在減少腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有了一定協(xié)同作用,這也許可能成為解釋局部復(fù)發(fā)率下降的 1個(gè)很重要的原因,并且也在一定程度上支持了在保乳手術(shù)中術(shù)中放療這一技術(shù)的可行性,而這對于廣大乳腺癌患者來說毫無疑問是 1個(gè)福音,同時(shí)術(shù)中放療既可以減少對皮膚、皮下組織及對側(cè)胸壁和肺的射線損傷,避免了大多數(shù)患者不宜接受長期術(shù)后放療,縮短了患者住院時(shí)間及術(shù)后放療劑量,減少了放療的費(fèi)用。

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