康曉琳，薛永志，武潤生，劉和莉

(1.包頭醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060;2.內(nèi)蒙古北方重工集團(tuán)有限公司醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014030)

酒精性肝損傷是常見的致肝硬化原因，由酒精性肝損傷引起的酒精性肝病的發(fā)病率有迅速增加趨勢，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。細(xì)胞色素P450 CYP2E1(cytochrome P-450 CYP2E1，CYP2E1)和細(xì)胞色素 P450 CYP3A(cytochrome P-450 CYP3A，CYP3A)是主要在肝臟表達(dá)的細(xì)胞色素P450重要的亞型［1］，病毒侵襲和免疫刺激等因素都會使其蛋白表達(dá)和代謝活力發(fā)生變化［2－3］。國內(nèi)對酒精性肝損傷的研究主要集中在氧化損傷等方面，而參與氧化代謝的重要代謝酶亞型CYP2E1和CYP3A在白酒致酒精性肝損傷中的變化及其作用環(huán)節(jié)尚未明確。氯唑沙宗(chlorzoxazone)主要經(jīng)CYP2E1代謝，是常用的探針?biāo)幬?咪達(dá)唑侖(midazolam)主要經(jīng)CYP3A酶代謝，也常作為探針?biāo)幬镉糜跈z測CYP3A。本研究采用大劑量白酒灌胃法制備大鼠急性酒精性肝損傷模型［4］，觀察經(jīng)CYP2E1代謝的探針?biāo)幬锫冗蛏匙谘帩舛冉?jīng)時(shí)變化及其鎮(zhèn)痛效果的變化，觀察經(jīng)CYP3A代謝的探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖血藥濃度經(jīng)時(shí)變化，探討肝損傷過程中CYP2E1和CYP3A代謝酶的變化，為深入揭示酒精性肝損傷機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

Wistar大鼠，清潔級，雄性，動物許可證號:SCXK(蒙)2002-0001，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體重180～200 g，室溫22～24℃，分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前，大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。氯唑沙宗對照品、氯唑沙宗片劑，山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所提供;咪達(dá)唑侖注射劑，徐州恩華集團(tuán)藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號，20080604;乙腈，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號:20040527，色譜純;甲醇，天津永大試劑廠生產(chǎn)，批號:20080421，色譜純。高效液相色譜(HPLC)分析儀，美國Thermo Finnigon公司生產(chǎn)，500V/Vis紫外檢測器，SeriesⅢ型泵，7725手動進(jìn)樣閥，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm);Sartorius酸度計(jì)，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn);LD4-2低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn);Sartorius分析天平，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn);GM-0.33隔膜真空泵，天津市騰達(dá)過濾器件廠生產(chǎn);OA-sys氮吹儀和C386OA超聲波清洗脫氣機(jī)，美國Organomation公司生產(chǎn);RB-200智能熱板儀，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 酒精性肝損傷大鼠模型的制備及鑒定

取雄性Wistar大鼠52只，體重180～200 g，隨機(jī)分為2組，正常對照組和酒精性肝損傷模型組，大鼠ig給予56%(V/V)紅星二鍋頭白酒2 ml，每日2次，間隔8 h，共2周。正常對照組大鼠ig給予等體積生理鹽水。第14天斷飼。第1天和第15天稱量體重，觀察體重變化情況，第15天隨機(jī)抽取上述正常對照、酒精性肝損傷組大鼠各8只，經(jīng)眶靜脈叢采血4 ml，3000 ×g 離心10 min，血清置 －20℃冰箱冷凍待測。檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)活性。將上述已經(jīng)采血的16只大鼠頸椎脫臼處死，迅速剖取肝臟，沖洗后稱重。每組隨機(jī)取其中的1只大鼠肝臟，在距肝臟邊緣0.5 cm處取材，10%甲醛固定，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝臟的組織形態(tài)。

1.3HPLC法測定大鼠ig給予氯唑沙宗后的血藥濃度

于實(shí)驗(yàn)第15天另取正常對照、酒精性肝損傷模型組大鼠各5只，單次ig給予氯唑沙宗50 mg·kg－1，分別于給藥前、給藥后0.5，1，2，3，4 和 6 h 從眼內(nèi)眥靜脈叢采血 0.5 ml，2000 ×g離心 5 min，取血漿，－20℃保存。按照文獻(xiàn)［3］報(bào)道的方法進(jìn)行血樣預(yù)處理并測定氯唑沙宗的血藥濃度。應(yīng)用藥物代謝動力學(xué)3P87軟件對血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)。通過測定血漿中探針?biāo)幬锫冗蛏匙谘帩舛?時(shí)間曲線及藥代動力學(xué)參數(shù)的變化，反映CYP2E1代謝活性的變化。

1.4 熱板法測定氯唑沙宗對酒精性肝損傷大鼠的鎮(zhèn)痛效果

于第15天取上述正常對照組和酒精性肝損傷組大鼠各8只，單次ig給予氯唑沙宗80 mg·kg－1，1.5 h后，采用熱板法［5］測定大鼠舔足反射潛伏期和5 min內(nèi)舔足次數(shù)，根據(jù)氯唑沙宗鎮(zhèn)痛作用效果差異間接評價(jià)CYP2E1代謝活性。

1.5 HPLC法測定大鼠ip給予咪達(dá)唑侖注射液后的血藥濃度

于實(shí)驗(yàn)第15天取上述正常對照和酒精性肝損傷組大鼠各5只，均經(jīng)ip給予咪達(dá)唑侖注射液10 mg·kg－1。給藥后經(jīng)眶靜脈叢分別采集 15，30，45 min，1和2 h的血漿樣品各0.5 ml，2000×g離心10 min，得血漿，－20℃保存待測。根據(jù)文獻(xiàn)［6］進(jìn)行血樣的預(yù)處理和采用HPLC法測定血漿中CYP3A探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖的血藥濃度。用藥物代謝動力學(xué)軟件3P87對血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算濃度-時(shí)間曲線下面積(area under the concentration-time curve，AUC)、半衰期 (half-life，t1/2)和清除率(clearance，Cl)等藥代動力學(xué)參數(shù)。通過血漿中探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖血藥濃度-時(shí)間曲線及藥代動力學(xué)參數(shù)的變化，反映CYP3A代謝活性的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 酒精性肝損傷大鼠肝臟病理組織學(xué)變化

圖1 乙醇對大鼠肝組織的影響 (HE×200).A:正常對照組，大鼠ig給予生理鹽水2 ml，每天2次;B:酒精性肝損傷組，大鼠ig給予白酒(V/V，56%)2 ml，每日2次，間隔8 h，共14 d.第15天取肝組織觀察大鼠肝臟病理組織學(xué)變化.Fig.1 Effect of alcohol on liver of rats(HE ×200).

各組大鼠肝臟切片HE染色光鏡下觀察顯示，正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，呈放射狀。肝細(xì)胞大小一致，核呈圓形，核仁清楚，胞漿粉染，匯管區(qū)無炎癥細(xì)胞浸潤(圖1A);酒精性肝損傷組大鼠可見明顯的損傷性改變，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞體積增大，呈彌漫性中度水變性，肝竇受壓，大部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)見大小不等的脂肪空泡，嚴(yán)重者融合成大的脂滴，將肝細(xì)胞核推擠至一側(cè)，尤以小葉外周的肝細(xì)胞更為明顯(圖1B)。

2.2 酒精性肝損傷大鼠體重增加量、肝重系數(shù)和肝功能的變化

與正常對照組大鼠體重增加量(62±22)g相比，酒精性肝損傷組體重增加量(29±13)g，明顯減少(n=8，P＜0.01);肝重系數(shù)明顯增加0.038±0.002 vs(0.054 ±0.006)g·g－1(n=8，P ＜ 0.01);酒精性肝損傷組大鼠血清GPT和GOT活性分別增加了16.0%和20.0%(P ＜0.05，P ＜0.01)(表1)。

表1 乙醇對大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)水平的影響Tab.1 Effect of alcohol on glutamic pyruvic transaminase(GPT)and glutamic oxaloacetic transaminase(GOT)in rats

2.3 酒精性肝損傷對大鼠CYP2E1酶代謝活性的影響

分別給予正常大鼠和肝損傷模型大鼠單次ig給予CYP2E1特異性探針?biāo)幬锫冗蛏匙?0 mg·kg－1，藥代動力學(xué)結(jié)果(圖2，表2)顯示，與正常對照組大鼠相比，酒精性肝損傷組大鼠口服氯唑沙宗后，各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度均顯著降低，其中酒精性肝損傷組大鼠cmax，AUC和t1/2較對照組分別減少了35%，38%和30.5%(P ＜0.05)，而 tmax和 Cl沒有顯著性差異。提示酒精性肝損傷致使大鼠對探針?biāo)幬锫冗蛏匙诘拇x活性增強(qiáng)。

圖2 大鼠ig給予氯唑沙宗后的血藥濃度-時(shí)間曲線.第15天取按圖1說明分組的大鼠，單次ig給予氯唑沙宗50 mg·kg－1，分別于給藥前、給藥后0.5，1，2，3，4和6 h采血.±s，n=5.*P＜0.05，與同一時(shí)間點(diǎn)正常對照組比較.Fig.2 Concentration-time curve of chlorzoxazone in plasma after rats were given ig chlorzoxazone 50 mg·kg －1.

表2 大鼠單次ig給予氯唑沙宗后的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetics parameteres of chlorzoxazone 50 mg·kg －1given ig in rats

2.4 酒精性肝損傷對氯唑沙宗鎮(zhèn)痛效果的影響

表3結(jié)果顯示，與正常對照組大鼠相比，酒精性肝損傷組大鼠ig給予CYP2E1特異性探針?biāo)幬锫冗蛏匙?0 mg·kg－1后，舔足反應(yīng)潛伏期明顯縮短，舔足反射次數(shù)顯著增多(P＜0.01)，說明 CYP2E1代謝活性增強(qiáng)。

表3 酒精性肝損傷對氯唑沙宗鎮(zhèn)痛效果的影響Tab.3 Impact of alcohol-induced hepatic injury on analgesic effect of chlorzoxazone 80 mg·kg －1given ig in rats

2.5 酒精性肝損傷對大鼠CYP3A酶代謝活性的影響

圖3 大鼠ip給予咪達(dá)唑侖后的血藥濃度-時(shí)間曲線.第15天取圖1中各組大鼠單次ip給予咪達(dá)唑侖10 mg·kg－1.±s，n=5.*P＜0.05，與同一時(shí)間點(diǎn)正常對照組比較.Fig.3 Concentration-time curve of midazolam in plasma after rats were given ip midazolam 10 mg·kg －1.

表4 大鼠ip給予咪達(dá)唑侖后的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of midazolam 10 mg·kg －1given ip in rats

正常大鼠和肝損傷模型大鼠ip給予CYP3A特異性探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖注射液10 mg·kg－1，藥代動力學(xué)結(jié)果(圖3和表4)顯示，與正常對照組大鼠相比，酒精性肝損傷組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度均顯著降低(P ＜0.05)，AUC，t1/2和 cmax較對照組分別減少了122.5%，54.9%和56.9%，Cl增大了 41.0%(P ＜0.01，P ＜0.05)。提示酒精性肝損傷致大鼠CYP3A的代謝活性增強(qiáng)。

3 討論

本研究采用大劑量白酒灌胃法制備酒精性肝損傷模型，誘導(dǎo)2周后，轉(zhuǎn)氨酶增加，肝功能受損，體重相對減輕，肝重增加，組織病理學(xué)可見，形成以肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性為特征的急性酒精性肝損傷模型，與人類酒精性肝損傷病理學(xué)特征相似。

CYP2E1是主要在肝臟表達(dá)的藥物代謝酶的重要亞型［3］，CYP2E1在不同動物種屬間較為保守，人與嚙齒類動物如大鼠或小鼠的CYP2E1氨基酸序列可具有78%的同源性，其代謝底物和代謝活性亦極為相似，因此有關(guān)CYP2E1的藥理學(xué)動物實(shí)驗(yàn)對臨床具有重要的參考價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，酒精性肝損傷組在給予氯唑沙宗后各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度均較正常對照組顯著降低，cmax減少，AUC減少，提示酒精性肝損傷可使CYP2E1酶蛋白在代謝活性水平明顯增強(qiáng)。同時(shí)，熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，乙醇損傷組大鼠氯唑沙宗鎮(zhèn)痛作用減弱，從藥效學(xué)角度反映CYP2E1代謝活力增強(qiáng)。CYP2E1可催化乙醇產(chǎn)生過氧化物，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，在酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制中起重要作用［7］。乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛、脂肪酸等經(jīng)肝CYP2E1系統(tǒng)代謝，酒精性肝損傷導(dǎo)致CYP2E1代謝能力的增強(qiáng)，可產(chǎn)生大量的活性氧基團(tuán)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，可損害各種細(xì)胞器和酶的結(jié)構(gòu)功能，抑制蛋白酶體的活性，降低蛋白酶體對乙醛加合物蛋白的水解作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷［8］。

CYP3A是肝臟與小腸中含量最為豐富的CYP450藥物代謝酶系，屬于CYP3A基因家族的CYP450在肝臟CYP450酶總含量中約占25%，不僅在外源性藥物與毒物的代謝中起著極為重要的作用，臨床常用藥物中亦約有50%經(jīng)由CYP3A代謝。CYP3A也催化許多內(nèi)源性激素的代謝，如睪酮及可的松的6-β-羥化代謝等，在維持動物生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起重要作用，并且對一些細(xì)胞因子很敏感［9］。目前，關(guān)于酒精性肝損傷過程中CYP3A代謝活性是否增強(qiáng)不同實(shí)驗(yàn)室得出不同的結(jié)果。有報(bào)道，中度酒精性肝損傷CYP3A活性無變化，但是減少咪達(dá)唑侖口服生物利用度，可能是腸內(nèi)CYP3A誘導(dǎo)的結(jié)果［9］。還有報(bào)道，中度酒精性肝損傷與CYP3A活性密切相關(guān)，明顯增加其代謝活性，但CYP3A上調(diào)機(jī)制尚未明確，可能與核受體轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)有關(guān)［10］。本研究觀察到急性乙醇刺激誘導(dǎo)CYP2E1，引起探針?biāo)幬锫冗蛏匙诖x增強(qiáng)的同時(shí)，也誘導(dǎo)了CYP3A的代謝活性，導(dǎo)致了探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖代謝增強(qiáng)，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)［10］報(bào)道一致。CYP3A、CYP2E1均屬于膜結(jié)合蛋白，其代謝活性的上調(diào)導(dǎo)致其氧化能力的增強(qiáng)，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化，進(jìn)一步加重肝損傷，形成惡性循環(huán)，上述分析提示，急性酒精性肝損傷機(jī)制主要是氧化損傷，藥物代謝酶的高誘導(dǎo)性可能參與損傷機(jī)制，有關(guān)酒精性肝損傷過程中代謝酶上調(diào)機(jī)制及其調(diào)控環(huán)節(jié)目前尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

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