豬苓多糖通過Toll樣受體4對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活化作用

許 文，李心群

(溫州醫(yī)學(xué)院1.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，2.附屬第一醫(yī)院急診科，浙江溫州 325035)

豬苓為多孔菌科真菌豬苓〔Polyporus umbellatus(Pers.)Fries〕的干燥菌核，具有利尿和抗腫瘤活性［1－2］。豬苓多糖(polyporus polysaccharides，PPS)是從豬苓中提取的多糖類物質(zhì)，具有抗癌瘤、增強(qiáng)免疫功能、保護(hù)肝臟和修復(fù)肝組織損傷等作用，PPS注射液已用于肝炎及腫瘤的輔助治療［2－4］。目前對PPS的作用機(jī)制尚未闡明。為探討其作用機(jī)制，本研究觀察了PPS對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)、白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)的影響，并制備了熒光胺(fluoresceinamine，F(xiàn)lu)標(biāo)記的PPS(Flu-PPS)，以嘗試確定PPS所識別的靶分子，為進(jìn)一步研究其藥理作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)基因野生型、對脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)敏感的小鼠C3H/HeN和TLR4基因突變、對LPS不敏感的C3H/HeJ小鼠，雌性，6～8周，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2007-0005。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)CS)和 RPMI 1640培養(yǎng)基為 Hyclone產(chǎn)品;小鼠 IL-1β和 TNF-α ELISA試劑盒為R＆D公司產(chǎn)品;LPS鱟試劑及NO檢測試劑盒購自Sigma公司;抗小鼠TLR4和TLR2單抗及抗補(bǔ)體受體CR3單抗CD11b購自eBiosciences公司，上述抗體在用于細(xì)胞培養(yǎng)之前均用磷酸鹽緩沖液(PBS)透析以去除其中的疊氮鈉;RPMI 1640完全培養(yǎng)基:以RPMI 1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入10%的滅活 FCS，青霉素62.5 mg·L－1及鏈霉素100 g·L－1;陰性對照多糖——葡聚糖(dextran)，相對分子質(zhì)量70 000，購自Sigma公司;硫代羥基乙酸鈉(thioglycollate，TG)為北京生物制品研究所產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀，F(xiàn)ACScan，美國B＆D公司;Bio-Rad Model 550酶標(biāo)儀，美國伯樂公司;激光共聚焦顯微鏡，Leica TCS SP2，德國Leica公司。

1.2 PPS 的制備

采用水浸提-乙醇沉淀提取法提取 PPS［5］。粉碎的豬苓用熱水浸提，索氏提取器抽濾。濾液經(jīng)濃縮后用乙醇沉淀，沉淀物依次經(jīng)乙醇、丙酮和乙醚洗滌后，用Sevage法去除蛋白質(zhì)。所得粗多糖用水透析，凍干保存。苯酚-硫酸法檢測多糖含量＞95%。劉小平等［5］用紫外與紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，PPS表現(xiàn)出β-D-葡萄吡喃糖的特征吸收;氣相色譜分析表明，其主要由D-葡萄糖和少量的D-半乳糖和D-甘露糖組成，經(jīng)尺寸排除色譜和激光光散射聯(lián)用儀測得PPS平均相對分子質(zhì)量為1.6×105，分子質(zhì)量分布(重均分子質(zhì)量/數(shù)均分子質(zhì)量)為2.914。經(jīng)鱟試劑法檢測，PPS 中 LPS 含量 ＜0.4 μg·g－1。

1.3 PPS及葡聚糖的熒光標(biāo)記

Flu-PPS及Flu-葡聚糖采用溴化氰活化的方法制備［6］，即0.2 ml溴化氰 50 g·L－1加于 1 ml PPS或葡聚糖 (20 g·L－1)，用 NaOH 0.2 mol·L－1調(diào) pH至 11.0，反應(yīng)15 min，然后以 pH 8.0 硼酸鹽緩沖液透析20 h?；罨腜PS或葡聚糖與2 mg Flu反應(yīng)10 h后，葡聚糖凝膠(Sephadex G-50)柱層析分離標(biāo)記多糖，得到 Flu-PPS和 Flu-葡聚糖。PPS，F(xiàn)lu-PPS，葡聚糖和Flu-葡聚糖均溶于RPMI 1640完全培養(yǎng)基，并經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌，4℃保存。

1.4 脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的測定

頸椎脫臼處死2種小鼠，無菌條件下分別取脾臟，制成脾細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞，用RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞密度為4 ×109L－1，于96 孔板每孔加入100 μl，分別與不同濃度的葡聚糖、PPS或Flu-PPS于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72 h，于終止培養(yǎng)前8 h，每孔加入5.4 Bq［3H］TdR，收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙，β-粒子計(jì)數(shù)器測定放射活性(cpm)，每樣品3個(gè)復(fù)孔。

1.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備

小鼠腹腔注射3%TG溶液，每只2 ml，72 h后脫頸椎處死，收集腹腔洗液，貼壁2 h，去除非貼壁細(xì)胞，即為所需腹腔巨噬細(xì)胞。調(diào)細(xì)胞密度為2×106L－1，錐蟲藍(lán)染色法檢查細(xì)胞存活率＞95%。

1.6 Griess法檢測C3H/HeN小鼠腹腔巨細(xì)胞培養(yǎng)上清一氧化氮濃度

C3H/HeN小鼠腹腔巨細(xì)胞與PPS(終濃度為12.5，25，50 和 100 mg·L－1)，LPS 1 mg·L－1或葡聚糖50 mg·L－1作用24 h后，檢測上清中亞硝酸鹽含量。

1.7 ELISA法檢測C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔巨細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-1β及TNF-α含量

分別取C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬細(xì)胞2×106加于 24孔板內(nèi)，分別與葡聚糖 50 mg·L－1，LPS 1 mg·L－1或不同濃度 PPS(終濃度為12.5，25，50 和100 mg·L－1)于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書操作，檢測上清中IL-1β及TNF-α含量。

1.8 抗體中和實(shí)驗(yàn)

取C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞先分別與抗TLR4，TLR2 及 CR3 單抗 20 mg·L－1作用 1 h，再加入 PPS 50 mg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，檢測上清中IL-1β和TNF-α含量。

1.9 流式細(xì)胞儀及激光共聚焦顯微鏡分析C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面PPS識別靶分子

收集C3H/HeN小鼠腹腔巨細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度為1×109L－1，加入Eppendorf管離心，于細(xì)胞沉淀中加入50 μl Flu-PPS或 Flu-葡聚糖 1 mg·L－1，4℃冰箱中避光反應(yīng)30 min，用 PBS 洗2次，激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型(CellQuest軟件分析)。竟?fàn)幰种茖?shí)驗(yàn)時(shí)，腹腔巨噬細(xì)胞先與未標(biāo)記的 PPS 100 mg·L－1或抗 TLR4，TLR2 或 CR3 單抗 200 mg·L－1反應(yīng) 30 min，再與Flu-PPS或Flu-葡聚糖反應(yīng)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PPS對C3H/HeN小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

如圖1所示，與RPMI 1640對照組相比，PPS具有促進(jìn)C3H/HeN小鼠脾細(xì)胞增殖的作用，［3H］TdR摻入值明顯增高，在 12.5 ～50 mg·L－1濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴效應(yīng)(r=0.999，P＜0.01);葡聚糖對脾細(xì)胞增殖反應(yīng)無促進(jìn)作用。經(jīng)鱟試劑法檢測，PPS 中 LPS 含量 ＜0.4 μg·g－1，排除了這種作用是由于PPS樣品受到LPS的污染所致。

另外，為了檢測經(jīng)熒光標(biāo)記后，PPS的活性是否發(fā)生了改變，同時(shí)觀察了Flu-PPS對C3H/HeN小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)lu-PPS對小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的促進(jìn)作用與PPS相近(圖1)，在12.5 ～ 50 mg·L－1濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴效應(yīng)(r=0.999，P ＜0.01)，表明 Flu 標(biāo)記對 PPS 的免疫活性無明顯影響，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 豬苓多糖(PPS)和熒光胺(Flu)標(biāo)記的PPS(Flu-PPS)對C3H/HeN小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響.C3H/HeN小鼠脾細(xì)胞分別與不同濃度的PPS，F(xiàn)lu-PPS或葡聚糖孵育，對照組以等體積的RPMI 1640培養(yǎng)基代替受試藥物，孵育72 h后用［3H］TdR摻入法測定放射活性.±s，n=3.＊＊P＜0.01，與RPMI 1640組比較.Fig.1 Effects of polyporus polysaccharides(PPS)and fluoresceinamine(Flu)labeledPPS(Flu-PPS)on splenocyte proliferation of C3H/HeN mice.

2.2 PPS對C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO，IL-1β和TNF-α產(chǎn)生的影響

PPS 12.5，25，50 及 100 mg·L－1與 C3H/HeN 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞孵育24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO，IL-1β和TNF-α濃度與RPMI 1640組比較明顯增加(表 1)，具有濃度依賴效應(yīng) (NO:r=0.858，P ＜0.01;IL-1β:r=0.936，P ＜ 0.01;TNF-α:r=0.903，P ＜0.01)，表明 PPS 具有活化巨噬細(xì)胞的作用。由于這3種活性物質(zhì)與巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性相關(guān)，因此推測PPS可能通過激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子發(fā)揮抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用。

2.3 抗TLR4單抗對PPS促進(jìn)C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和TNF-α的抑制作用

在加入PPS 50 mg·L－1前，加入抗TLR4單抗20 mg·L－1作用1 h，C3H/HeN 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL-1β 和TNF-α 濃度與 PPS 50 mg·L－1單用組比較明顯降低，降幅達(dá) 52.6% 和 58.6%(P＜0.01);而同型抗體(IgG1)、抗 TLR2及 CR3單抗分別與腹腔巨噬細(xì)胞預(yù)孵育，培養(yǎng)上清中IL-1β和TNF-α濃度與PPS 50 mg·L－1單用組比較無明顯差異;提示PPS可能經(jīng)TLR4促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1β 和 TNF-α(表2)。

2.4 PPS對C3H/HeN和 C3H/HeJ小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和TNF-α的影響

由表3～表5所示，為了探討PPS促進(jìn)脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和活化巨噬細(xì)胞的作用是否通過TLR4發(fā)揮作用，比較了PPS對C3H/HeN和C3H/HeJ脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β及TNF-α的影響。結(jié)果表明，PPS 12.5，25，50 及 100 mg·L－1對C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)均具促進(jìn)作用(P＜0.01)，并促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β及TNF-α。PPS對C3H/HeN小鼠的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于 C3H/HeJ小鼠是 PPS 12.5 ～100 mg·L－1組，脾細(xì)胞增殖反應(yīng)增加了 2.4，1.7，1.5 和 22.2倍，IL-1P 產(chǎn)生分別增加了 0.9，1.3，1.2 和 1.1倍，TNF-α 產(chǎn)生分別增加了 1.3，0.9，0.6 和 0.6倍。由于C3H/HeJ小鼠屬于TLR4受體缺陷小鼠，不能通過TLR4傳導(dǎo)信號，故本結(jié)果進(jìn)一步提示PPS可能是通過TLR4發(fā)揮對脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化作用。

表1 PPS對C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)，白細(xì)胞介素1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響Tab.1 Effect of PPS on production of nitric oxide(NO)，interleukin-1β(IL-1β)and tumor neceosis factor-α (TNF-α)by peritoneal macrophages of C3H/HeN mice

表2 抗Toll樣受體4(TLR4)單抗對PPS刺激C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β及TNF-α的影響Tab.2 Effect of anti-Toll like receptor 4(TLR4)monoclonal antibody on promotion of PPS on IL-1β and TNF-α production of peritoneal macrophages of C3H/HeN mice

表3 PPS對C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響Tab.3 Effects of PPS on splenocyte proliferation of C3H/HeN and C3H/HeJ mice

表4 PPS對C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響Tab.4 Effects of PPS on IL-1β production of peritoneal macrophages of C3H/HeN and C3H/HeJ mice

表5 PPS對C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響Tab.5 Effects of PPS on TNF-α production of peritoneal macrophages of C3H/HeN and C3H/HeJ mice

2.5 PPS在C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面識別的靶分子

為進(jìn)一步證實(shí)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面具有PPS識別的靶分子，觀察了Flu-PPS與巨噬細(xì)胞的結(jié)合。Flu-PPS和Flu-葡聚糖分別與C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，F(xiàn)lu-PPS 1 mg·L－1與巨噬細(xì)胞結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于 Flu-葡聚糖組，且 Flu-PPS 5 mg·L－1時(shí)熒光強(qiáng)度并未明顯增加(圖2)，表明PPS與腹腔巨噬細(xì)胞的結(jié)合具有飽和性，提示巨噬細(xì)胞表面具有PPS識別的靶分子。激光共聚焦顯微鏡分析亦發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lu-PPS與巨噬細(xì)胞孵育后在巨噬細(xì)胞表面形成了綠色的熒光環(huán)(圖3)。

圖2 Flu-PPS與C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面特異結(jié)合.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別與Flu-PPS或Flu-葡聚糖4℃避光反應(yīng)30 min后，流式細(xì)胞儀分析與巨噬細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度.Fig.2 Specific binding of Flu-PPS to peritoneal macrophages of C3H/HeN mice.

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測Flu-PPS與Flu-葡聚糖與C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞結(jié)合.A:Flu-PPS;B:Flu葡聚糖.Fig.3 Binding of Flu-PPS or Flu-dextran with peritoneal macrophages of C3H/HeN mice observed using confocal laser-scanning microscope.

為證實(shí)Flu-PPS與巨噬細(xì)胞膜表面分子作用的特異性，本研究進(jìn)行了一系列的阻斷實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，過量的未標(biāo)記的PPS 100 mg·L－1可抑制Flu-PPS 1 mg·L－1與巨噬細(xì)胞的結(jié)合(圖4A);另外，抗TLR4單抗可顯著抑制Flu-PPS與巨噬細(xì)胞的結(jié)合(圖4B)，而抗TLR2及補(bǔ)體受體CR3單抗則無明顯的抑制作用(圖4C)。結(jié)合2.3及2.4結(jié)果可以表明，巨噬細(xì)胞表面存在PPS結(jié)合的靶分子，TLR4可能是其主要的靶分子。由于與未標(biāo)記的PPS的抑制作用比較，抗TLR4抗體的阻斷作用相對較弱，表明巨噬細(xì)胞表面可能還存在其他的靶分子。

圖4 PPS與抗TLR4單抗抑制Flu-PPS與C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的結(jié)合.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與PPS 100 mg·L－1及抗TLR4，TLR2或補(bǔ)體受體CR3單抗200 mg·L－14℃孵育1 h，PBS洗滌后加入Flu-PPS 1 mg·L－1，繼續(xù)反應(yīng)30 min后，流式細(xì)胞儀分析顯示未標(biāo)記的PPS(A)及抗TLR4單抗(B)可顯著抑制Flu-PPS與巨噬細(xì)胞的結(jié)合，而抗TLR2及CR3單抗則無明顯抑制作用(C).Flu-葡聚糖組只加入Flu-葡聚糖 1 mg·L －1，反應(yīng) 30 min 后檢測.Fig.4 Inhibition of Flu-PPS binding to peritoneal macrophages of C3H/HeN mice by unlabeled PPS and anti-mouse TLR4 monoclonal antibody.

3 討論

PPS是從豬苓中提取出的水溶性多糖，具有廣泛的生物學(xué)活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，PPS可使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng)，增強(qiáng)T細(xì)胞增殖，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，并具有抑制腫瘤生長和增強(qiáng)免疫功能的作用［2，4］。本研究結(jié)果表明，PPS具有促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖及腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，IL-1β及TNF-α的活性，且這種活性與TLR4有關(guān)。

由于LPS具有很強(qiáng)的活化巨噬細(xì)胞的作用，亦能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO及各種細(xì)胞因子。為了排除樣本中可能的LPS污染，本研究采用鱟試劑法檢測了PPS中LPS的含量，發(fā)現(xiàn)樣本中LPS含量遠(yuǎn)低于活化巨噬細(xì)胞所需的濃度，并不足以干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

中藥多糖生物活性的發(fā)揮可能有賴于與細(xì)胞上相應(yīng)受體的相互作用，而巨噬細(xì)胞在固有免疫及獲得性免疫反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。因此，發(fā)現(xiàn)并研究巨噬細(xì)胞表面中藥多糖受體和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，對揭示中藥多糖免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用機(jī)制具有重要的理論及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

已有研究表明，巨噬細(xì)胞功能的發(fā)揮與其表面所謂的模式識別受體(pattern recognition receptor)如TLR4，TLR2，CR3，甘露糖受體及dectin-1等有關(guān)。TLR4可結(jié)合多種病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns)而活化。TLR活化后，可以促進(jìn)機(jī)體抗感染和抗癌活性，如促進(jìn)巨噬細(xì)胞NO的釋放，并且可以通過誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，天然來源的多糖可以通過TLR4介導(dǎo)多種免疫細(xì)胞激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，活化轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。如紅花多糖［8］和刺五加多糖［9］等可通過TLR4活化腹腔巨噬細(xì)胞導(dǎo)致NO和TNF-α的產(chǎn)生，且與 NF-κB 的活化有關(guān)。Hsu 等［10－11］研究表明，靈芝多糖亦可通過TLR4活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞表型與功能成熟。因此，天然來源的多糖作為TLR的候選配體在治療感染性疾病和癌癥方面具有廣闊的前景。

基于以上發(fā)現(xiàn)與研究，筆者推測PPS也可通過與TLR4作用來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。為確定此假設(shè)，本研究比較了PPS對C3H/HeN小鼠和TLR4基因缺陷的C3H/HeJ小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，IL-1β及TNF-α的影響。結(jié)果表明，PPS 12.5，25，50 及 100 mg·L－1能顯著刺激C3H/HeN小鼠脾細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，IL-1β 及 TNF-α;對 C3H/HeJ小鼠脾細(xì)胞增殖及腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌具有一定的促進(jìn)作用，但明顯弱于對C3H/HeN小鼠的促進(jìn)作用;由此提示，PPS活性與TLR4有關(guān)。用抗TLR4抗體封閉后，PPS刺激腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β及TNF-α的作用下降達(dá)52.6%和58.6%，進(jìn)一步表明PPS的活性與TLR4有關(guān)。

另外，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，F(xiàn)lu-PPS 1 mg·L－1與巨噬細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度明顯高于Flu-葡聚糖，增加Flu-PPS的濃度熒光強(qiáng)度并未相應(yīng)地增強(qiáng)，表明PPS與靶分子的結(jié)合具有飽和性;并且未標(biāo)記的PPS 100 mg·L－1能阻斷Flu-PPS與巨噬細(xì)胞的結(jié)合，表明巨噬細(xì)胞上具有PPS結(jié)合的靶分子，與激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抗TLR4抗體能夠阻斷Flu-PPS與巨噬細(xì)胞的結(jié)合，表明TLR4可能是PPS結(jié)合的靶分子。因此推測，PPS可能通過TLR4激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

PPS對C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO及細(xì)胞因子并非完全沒有影響，抗TLR4抗體也未能完全阻斷Flu-PPS與巨噬細(xì)胞的結(jié)合，提示除了TLR4之外，巨噬細(xì)胞表面可能還存在其他的PPS結(jié)合的靶分子，這一推測尚待進(jìn)一步研究。另外，本研究是用溴化氰活化的方法對PPS進(jìn)行了熒光標(biāo)記，雖然Flu-PPS與PPS比較其免疫活性未發(fā)生明顯變化，但該標(biāo)記方法主要是活化多糖上的羥基，沒有選擇性，多糖熒光標(biāo)記后是否會(huì)改變多糖的活性位點(diǎn)，是否會(huì)使多糖的活性結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，亦尚待進(jìn)一步研究。

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