糖尿病足是指糖尿病患者由于合并神經(jīng)病變和各種不同程度末梢血管病變而導致下肢感染、潰瘍和(或)深部組織破壞，屬于糖尿病常見嚴重慢性并發(fā)癥，也是糖尿病患者致殘主要原因之一。通過對糖尿病足截肢標本的分子生物學研究，進一步探討糖尿病足的發(fā)病機制，論述其與中醫(yī)辨證分型的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

100例糖尿病足截肢標本均來自天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院2005年8月至2007年7月住院患者。截肢患者中男61例，女39例，年齡54～88歲，平均68.3歲。截肢患者糖尿病病程最短8年, 最長31年, 平均(18±3.7)年。

1.1.1 診斷標準 糖尿病足的診斷標準采用2000年中華醫(yī)學會糖尿病學分會第2屆糖尿病足會議所制定的 “糖尿病足(肢端壞疽)檢查方法及診斷標準”。

1.1.2 截肢標準 參照國際糖尿病足工作組編寫的《糖尿病足國際共識》中關于“大截肢的定義、標準和指標”執(zhí)行。

1.1.3 排除標準 有嚴重的手術禁忌證、動脈硬化閉塞癥、急性動脈栓塞、雷諾病等其它肢體缺血性疾病。

1.1.4 中醫(yī)辨證分型標準 參照《中醫(yī)外科學(第7版)》及《中藥新藥臨床研究指導原則·脫疽》之中醫(yī)辨證分型方案分為氣血兩虛瘀阻、氣陰兩虛瘀阻、脈絡熱毒型3種證型。

1.2 方法

1.2.1 標本的留取 采取多層面留取，即按小腿上部、內(nèi)踝、足背3個部位分別留取。標本經(jīng)過10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，備用。

1.2.2 設備與試劑 α-肌動蛋白(α-actin)鼠抗人單克隆抗體(天津市津脈基因測繪技術有限公司提供)；SP-9000免疫組化染色試劑盒；ZLI-9031濃縮型DAB試劑盒(均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供)。

1.2.3 免疫組織化學法 標本常規(guī)石蠟包埋, 4μm連續(xù)切片,采用SP法進行免疫組化染色,染色過程嚴格按試劑盒染色程序進行，選取已知的陽性切片作陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。其中一抗?jié)舛葹?∶200。

1.2.4 圖像分析 采用圖像分析軟件(Image-Pro Plus Analysis software)測量，在400倍光鏡下，每張切片隨機取4個視野，測量平均光密度(MOD)，即400倍單位視野面積的平均光密度，其值與蛋白表達呈正比。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以表示，應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，采用方差分析。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

α-actin在糖尿病足的不同辨證分型的神經(jīng)組織以及動脈組織中表達均呈陽性，見圖1、圖2(彩圖見封3)。并且陽性的表達與證型之間有高度的相關性。在神經(jīng)組織以及動脈組織中均是脈絡熱毒證表達最強，氣血兩虛瘀阻證表達最弱。在神經(jīng)組織中：三證型間比較有顯著性差異，三證型中各部位比較均無顯著性差異。在動脈組織中：脈絡熱毒證與氣陰兩虛瘀阻證、氣陰兩虛瘀阻證與氣血兩虛瘀阻證、氣血兩虛瘀阻證與脈絡熱毒證比較均差異顯著。三證型內(nèi)部各部位比較除脈絡熱毒證中腓腸肌中點與足底部動脈比較差異有顯著性，其余差異均無顯著性。見表1～4。

圖1 ×400 α-actin在動脈中的陽性表達

圖2 ×400 α-actin在神經(jīng)中的陽性表達

中醫(yī)證型nMOD脈絡熱毒320.107±0.015氣陰兩虛瘀阻330.089±0.005氣血兩虛瘀阻350.081±0.017

注：三證型間比較，χ2=33.04，差異有顯著性(P<0.05)。

表2 各證型不同部位神經(jīng)組織中α-actin的表達

表3 各證型動脈中α-actin的表達

注：與脈絡熱毒比較，aP<0.05；與氣陰兩虛瘀阻比較，bP<0.05。

表4 各證型不同部位動脈中α-actin的表達

注：脈絡熱毒中腓腸肌中點與足底比較,aP<0.05。

3 討論

糖尿病肢端壞疽是一種慢性、進行性，涉及大、中、小及微血管的疾患，主要是代謝紊亂、肢端缺血、神經(jīng)病變、感染等多種誘因所致。糖尿病足的病變組織首先涉及血管及神經(jīng)，血管及神經(jīng)的病變不斷發(fā)展，進而引起肌肉的病變，糖尿病足的損傷首先表現(xiàn)在神經(jīng)、血管及肌肉等組織上，進而影響器官乃至整個系統(tǒng)，因此我們從血管、神經(jīng)這些組織入手，利用分子生物學研究這些組織微觀上的變化，進而研究糖尿病足的發(fā)病機制，探討其與中醫(yī)辨證分型的聯(lián)系及相關性。

肌動蛋白纖維參與構成微絲與細肌絲，是肌細胞和非肌細胞的運動成分[1]。血管內(nèi)皮細胞的骨架有三種結(jié)構：微絲、微管和中間絲，以微絲在維持內(nèi)皮細胞形態(tài)和完整性中所起作用最重要。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在成年個體是一種高度特化的細胞，具有收縮、調(diào)節(jié)血管張力和維持血壓等功能。α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle-actin，α-SM-actin)是細胞來源于平滑肌組織的標志，在不同表型的平滑肌細胞中具有不同的表達比例。根據(jù)其表達比例的不同，主要被分為兩種表型：收縮型、增殖型。成熟的VSMC處于較低的增殖速率，以收縮表型為主；在刺激因素如血清血小板衍化生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)等血漿反應因子(Serum response factor，SRF)作用下或血管內(nèi)膜損傷，VSMC表型發(fā)生改變，以合成表型為主，促使VSMC增殖、遷移，并產(chǎn)生多種胞外基質(zhì)如膠原、彈力蛋白、蛋白聚糖等，在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中起重要作用。α-SM-actin是平滑肌細胞分化成熟的最主要的細胞骨架蛋白，許多研究認為α-SM-actin是表現(xiàn)VSMC收縮表型的重要標記物。細胞內(nèi)α-SM-actin含量的改變與細胞表型轉(zhuǎn)變是一致的，其表達減少標志著細胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化[2-3]。本試驗也證實了隨著病情的不斷加重，VSMC由收縮性轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停偈筕SMC增殖，遷移，使中膜平滑肌細胞增殖明顯，以致管腔狹窄。加重缺血，使局部營養(yǎng)障礙，癥狀加重。

在神經(jīng)元發(fā)育過程中，神經(jīng)突起沿特定的路線生長、延長，并伸向?qū)⑴c它建立突觸聯(lián)系的靶細胞、神經(jīng)元的胞體、樹突或軸突。而在神經(jīng)突起伸長及向特定的方向生長方面，生長錐(growth cone)起決定作用。生長錐是個活躍運動的結(jié)構，其與神經(jīng)突起的生長、軸突的特殊途徑的選擇、靶細胞的識別和突觸的形成有關。神經(jīng)突起的生長、伸長只發(fā)生在生長錐。肌動蛋白在生長錐的可動性中可能起關鍵作用[4-5]。生長錐的板足及絲足的活躍運動有賴于肌動蛋白有序、快速的聚合和解聚。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，正是由于細胞骨架的參與，軸突才能循著正確的路徑長至相應的靶細胞。糖尿病足的發(fā)展過程中，隨著病變的發(fā)展，血管結(jié)構和功能逐漸破壞，進而影響到神經(jīng)，肌動蛋白生成減少，生長椎的可動性降低，抑制了神經(jīng)突起的生長，從而引起一系列的神經(jīng)癥狀，隨著病程的不斷增長，病情的不斷加重，神經(jīng)方面的癥狀也隨之越來越嚴重。

由實驗結(jié)果可以看出證型不同，細胞損傷也相應的有差別，特別在氣陰兩虛瘀阻證和脈絡熱毒證中表現(xiàn)尤為突出。氣血兩虛瘀阻證表達最低說明細胞受損嚴重，所以臨床中治療糖尿病足常用益氣養(yǎng)陰、清熱利濕、活血化瘀藥物以減輕癥狀，此研究結(jié)果為此法的廣泛應用提供了客觀的實驗依據(jù)，對臨床具有重要的指導意義。通過本實驗，證實了糖尿病足的中醫(yī)辨證分型與病理學之間有相關性，同時也表明了α-actin在糖尿病足的動脈、神經(jīng)中的作用和損傷機理及其與病情的關系，對這一問題的深入研究，可能為臨床防治糖尿病足提供新的思路，研究出作用于血管、神經(jīng)中肌動蛋白的藥物，從而抑制血管、神經(jīng)病變的發(fā)展，達到預防和控制糖尿病足的療效。

[1] Gardel ML, Nakamura F, Hartwig JH, et al.Prestressed F-actin networks cross-linked by hinged filamins replicate mechanical properties of cells[J].PNAS, 2006, 103 (6): 1762-1767.

[2]Frid MG, Shekhonin BV, Koteliansky VE, et al.Phenotypic changes of human smooth muscle cells during development:late expression of heavy caldesmon and calponin[J].Dev Biol, 1992, (153): 185-193.

[3]Marina A, Glukhova, Alexander E, et al.Modulation of human aorta smooth muscle call phenotype: a study of muscle-specific variants of vinculin,caldamon,and actin expession[J].Proc Natl Acad Sic USA, 1998, (85): 9542-9546.

[4]Suter DM.The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substratecytoskeletal coupling[J].J Cell Biol, 1998, 141 (1): 227-240.

[5]Letourneau PC.The cytoskeleton in nerve growth cone motility and axonal pathfinding[J].Perspect Dev Neurobiol, 1996, 4 (2-3): 111-123.