李淼，尚云曉，相云

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科，沈陽 110004）

神經(jīng)激肽 1受體（neurokinin-1 receptor，NK-1R）是感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)的受體，P物質(zhì)通過NK-1R起作用，其效應(yīng)包括氣道收縮、血管擴(kuò)張和血漿滲出、增加微血管滲透性。P物質(zhì)及其受體在哮喘氣道表達(dá)增高，參與哮喘的發(fā)病機(jī)制。P物質(zhì)受體拮抗劑已被廣泛應(yīng)用于臨床，大多應(yīng)用于臨床減輕疼痛、抗抑郁治療、抑制皮炎。P物質(zhì)受體拮抗劑對于氣道炎癥的作用處于試驗(yàn)階段，有實(shí)驗(yàn)證明NK-1R特異性的受體拮抗劑靜脈注射可以減輕由于吸煙導(dǎo)致的肺損傷和香煙導(dǎo)致的氣道炎癥［1］，也有研究證明NK-1R拮抗劑可以減輕機(jī)械通氣引起的細(xì)胞因子增高的不良反應(yīng)［2］。氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cell，ASMC）是氣道內(nèi)的效應(yīng)細(xì)胞，受氣道內(nèi)各種因素，尤其是各類免疫細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生相應(yīng)的收縮反應(yīng)，調(diào)節(jié)氣道的口徑，從而影響呼吸功能。在持續(xù)哮喘的病例中，在細(xì)胞外基質(zhì)的影響和各種細(xì)胞因子、炎性因子和生長因子的作用下，ASMC會出現(xiàn)增殖和遷移性生長的現(xiàn)象。白細(xì)胞介素 13（interleukin-13，IL-13）對 ASMC 有促進(jìn)增殖的作用。因此，本研究通過IL-13誘導(dǎo)ASMC增殖后給予NK-1R拮抗劑WIN62577，觀察WIN62577對大鼠ASMC生長曲線及細(xì)胞周期的影響，試圖說明WIN62577對ASMC增殖的作用；并通過Transwell小室方法研究WIN62577對大鼠ASMC遷移的作用，試圖探討WIN62577對哮喘大鼠氣道的作用，為哮喘的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料

雌性Wistar大鼠，6~8周齡，體質(zhì)量150~160 g，共15只，中國醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室動物部提供；飼養(yǎng)期間給予正常飲食，飼養(yǎng)條件一致。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，購自美國Hyclone公司；抗α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體，購自武漢博士德公司；MTT、胰蛋白酶、NK-1R拮抗劑WIN62577，購自美國Sigma公司；FITC山羊抗兔熒光二抗、Ⅳ型膠原酶，購自美國GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ASMC原代培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)［3］，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉后，左心室取血處死。無菌分離大鼠氣管，仔細(xì)剝離外膜，去除內(nèi)膜。將氣管平滑肌剪下，用含雙抗的DMEM培養(yǎng)液清洗后，將組織剪碎用0.1%的Ⅳ型膠原酶于37℃水浴下消化30 min兩次，待液體渾濁時(shí)用含10%胎牛血清的DMEM終止消化。1 000 r/min離心后用含10%胎牛血清DMEM重懸，200目濾網(wǎng)過濾后37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。3 d換液，7 d長滿培養(yǎng)瓶。用0.25%胰蛋白酶消化傳代后，利用成纖維細(xì)胞貼壁較快的特點(diǎn)純化ASMC，取第4代細(xì)胞用于檢測。

1.2.2 ASMC的鑒定：倒置顯微鏡下觀察，ASMC呈梭形或多角型，呈谷峰樣改變。以抗α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光FITC染色鑒定，胞漿呈綠色熒光的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。陰性對照組用PBS代替抗α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體。熒光倒置顯微鏡（IX51，日本OLYMPUS公司）下觀察照相。

1.2.3 MTT比色法分析WIN62577對IL-13誘導(dǎo)的大鼠ASMC增殖的影響：按照隨機(jī)分組的原則將第4代ASMC分為空白對照組、IL-13干預(yù)組和WIN62577+IL-13干預(yù)組。IL-13干預(yù)組用含IL-13（1×10-5g/L）的 DMEM 培養(yǎng)液干預(yù)；WIN62577+IL-13干預(yù)組用含 IL-13（1×10-5g/L）及 WIN62577（1×10-8g/L）的DMEM培養(yǎng)液干預(yù)；空白對照組用PBS代替IL-13及WIN62577。將處于對數(shù)生長期的第4代ASMC以2×104/ml的密度接種于96孔板，先用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h達(dá)到同步化。給予干預(yù)因素24、48和72 h后，每孔加MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加150μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀490 nm波長測定各孔吸光度值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。每組加5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測WIN62577對大鼠ASMC細(xì)胞周期的影響：實(shí)驗(yàn)分組同MTT比色法。將處于對數(shù)生長期的第4代ASMC調(diào)整為每瓶2×106/ml的密度，先用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h達(dá)到同步化。給予干預(yù)因素24 h后，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，70%乙醇固定過夜，給予RNA酶50 mg/L及溴化乙錠100 mg/L，4℃避光30 min檢測。計(jì)算G1、S和G2期細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室檢測WIN62577對ASMC遷移的作用：用正常大鼠5只原代培養(yǎng)第4代ASMC，當(dāng)ASMC生長至80%融合時(shí)，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM以1×105/ml密度重懸細(xì)胞，下室加入含 WIN62577（1×10-8g/L）和 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液600μl，上室加入細(xì)胞懸液100μ1，將小室置于37℃孵育箱，24 h后取出小室，小心取出濾膜，棉簽輕輕擦去微孔膜朝上一面未穿膜的細(xì)胞。膜下面的ASMC用4%多聚甲醛固定20 min，蘇木素染色10 min，二甲苯透明1 min，中性樹膠封片，倒置顯微鏡（×400）下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取均值。每次5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？瞻讓φ战M給予相同劑量的PBS代替WIN62577。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光鑒定ASMC

當(dāng)細(xì)胞長至融合狀態(tài)呈峰谷改變時(shí)進(jìn)行傳代，用第4代ASMC作為實(shí)驗(yàn)對象。用兔抗大鼠αactin、山羊抗兔FITC免疫熒光二抗染色鑒定ASMC，胞漿呈綠色熒光著色的細(xì)胞為ASMC。見圖1。

2.2 WIN62577對IL-13誘導(dǎo)的大鼠ASMC增殖的影響

IL-13干預(yù)組ASMC增殖較空白對照組ASMC明顯，24 h開始增殖，48 h達(dá)高峰，48和72 h兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；WIN62577+IL-13干預(yù)組與IL-13干預(yù)組及空白對照組比較，48及72 h ASMC增殖的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 WIN62577對大鼠ASMC細(xì)胞周期的影響

WIN62577+IL-13干預(yù)組ASMC各細(xì)胞周期的細(xì)胞比例分別為 G1期（85.0±2.5）%、S期（4.5±3.7）%、G2期（9.5±1.4）%，IL-13 干預(yù)組為 G1期（80.2±6.2）%、S 期（6.9±2.1）%、G2期（12.9±5.2）%，空白對照組為 G1期（75.2±5.2）%、S期（8.6±2.8）%、G2期（16.2±3.4）%。WIN62577+IL-13干預(yù)組 ASMC 大多停留于G1期，與IL-13干預(yù)組及空白對照組相比各期細(xì)胞比例的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。

2.4 Transwell小室分析WIN62577對ASMC遷移的作用

正常 ASMC 24 h 遷移細(xì)胞數(shù)為（23±3）/HP；加入WIN62577干預(yù)后ASMC遷移數(shù)為（16±2）/HP，與正常ASMC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

3 討論

哮喘是由多種細(xì)胞及其細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥，氣道重塑是哮喘的重要特征。哮喘氣道重塑的病理特點(diǎn)包括平滑肌細(xì)胞增生、肥大、氣道上皮下纖維化、黏液化生、細(xì)胞間質(zhì)的重塑及血管增多等。哮喘時(shí)ASMC是很重要的效應(yīng)細(xì)胞，在多種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的作用下尤其在哮喘氣道重塑時(shí)，ASMC產(chǎn)生收縮、增殖、遷移等生物學(xué)效應(yīng)。

IL-4和IL-13是TH2淋巴細(xì)胞釋放的主要的促炎因子［4］，在氣道疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。這兩種細(xì)胞因子改變氣道的完整性，導(dǎo)致氣道對各種刺激的反應(yīng)敏感性增加［5］。有學(xué)者通過動物實(shí)驗(yàn)證明IL-13基因敲除小鼠發(fā)生氣道高反應(yīng)性和氣道重塑的幾率減小，可見IL-13在哮喘氣道高反應(yīng)性和氣道重塑中起到重要作用［6］。增加平滑肌細(xì)胞的體積或改變平滑肌細(xì)胞的收縮特性都可以改變氣道的反應(yīng)性［7］。有研究報(bào)道，IL-13可以直接作用于平滑肌細(xì)胞增加乙酰膽堿對氣道的高反應(yīng)性［8］。由此可見，IL-13對氣道平滑肌細(xì)胞的作用在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。IL-13可以促進(jìn)ASMC增殖，參與氣道重塑［9］，因此，本研究通過MTT及流式細(xì)胞儀分析證明NK-1R拮抗劑有抑制IL-13介導(dǎo)的ASMC增殖的作用。MTT實(shí)驗(yàn)證明WIN62577對ASMC增殖的抑制作用從24 h開始，48 h達(dá)高峰。流式細(xì)胞儀分析提示ASMC細(xì)胞在給予WIN62577后大多停留于G1期。細(xì)胞周期有兩個(gè)關(guān)鍵的調(diào)定點(diǎn)，包括G1/S、G2/M的轉(zhuǎn)換。WIN62577將ASMC調(diào)定于G1期，G1期關(guān)系到整個(gè)細(xì)胞周期的啟動，而G1期向S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵是細(xì)胞周期蛋白D。因此，NK-1R拮抗劑對細(xì)胞周期蛋白D及其他調(diào)控基因的作用有待進(jìn)一步研究。另外，IL-13的生物活性是通過與細(xì)胞表面相應(yīng)的IL-13受體結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸而完成的，而P物質(zhì)是通過與其特異性NK-1R結(jié)合后，通過G蛋白與第二信使磷脂酸肌醇二磷酸相聯(lián)系，并通過三磷酸肌醇作用于膜上的鈣離子通道，引起膜電位的去極化和蛋白激酶活性改變而發(fā)揮作用的［10］。NK-1R拮抗劑通過什么途徑抑制IL-13誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖有待進(jìn)一步研究。

哮喘時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及炎性因子參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證明P物質(zhì)對哮喘患者嗜酸性粒細(xì)胞有活化和趨化作用［11］，本研究通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)證明WIN62577有抑制平滑肌細(xì)胞遷移的作用。

綜上所述，WIN62577有抑制ASMC增殖和遷移的作用，為治療哮喘新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

［1］Jacob S，Deyo DJ，Cox RA，et al.Mechanisms of toxic smoke inhalation and burn injury：roleof neutral endopeptidaseand vascular leakagein mice［J］.Toxicol Mech Methods，2009，19（3）：191-196.

［2］Pedreira PR，García-Prieto E，Parra D，et al.Effects of melatonin in an experimental model of ventilator-induced lung injury ［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295（5）：L820-L827.

［3］An SS，Laudadio RE，Lai J，et al.Stiffnesschangesin cultured airway smooth muscle cells［J］.Am JPhysiol Cell Physiol，2002，283（3）：792-801.

［4］O′Byrne PM，Inman MD，Adelroth E.Reassessing the Th2 cytokine basisof asthma［J］.Trends Pharmacol，2004，25（5）：244-248.

［5］Riffo-Vasquez Y，Pitchford S，Spina D.Cytokines in airway inflammation［J］.Int JBiochem Cell Biol，2000，32（8）：833-853.

［6］Leigh R，Ellis R，Wattie JN，et al.Type2 cytokinesin thepathogenesis of sustained airway dysfunction and airway remodeling in mice［J］.Am JRespir Crit Care Med，2004，169（7）：860-867.

［7］Walter DM，McIntire JJ，Berry G，et al.Critical role for IL-13 in the developmentofallergen-inducedairwayhyperreactivity［J］.JImmunol，2001，167（8）：4668-4675.

［8］Grunstein MM，Hakonarson H，Leiter J，et al.IL-13-dependent autocrine signaling mediates altered responsiveness of IgE-sensitized airway smooth muscle［J］.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2002，282（3）：L520-L528.

［9］Kellner J，Gamarra F，Welsch U，et al.IL-13R-2 reverses the effects of IL-13 and IL-4 on bronchial reactivity and acetylcholine-induced Ca2+signaling［J］.Int Arch Allergy Immunol，2007，142 （3）：199-210.

［10］Cascieri MA，Ber E，F(xiàn)ong TM，et al.Characterization of the binding of a potent，selective radioindinated antagonist to the human neurokinin-1 recepto［rJ］.Mol Pharmacol，1992，42（3）：458-463.