徐 鵬，張佑紅，楊 益，彭繼明，陳 龍，靖志強，危 威，馬 靜，秦 琴

(武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system, BEVS)由于其表達的高效性、安全性等諸多優(yōu)點，在重組蛋白生產(chǎn)、疫苗的研制以及生物殺蟲劑等方面具有很高的應用前景[1].為了提高重組蛋白或病毒的產(chǎn)量，必須準確測定桿狀病毒與細胞的濃度比，即感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)[2-3].目前病毒滴度的測定方法主要是蝕斑法和終點稀釋法(EPDA)[4-5]，兩種方法都是利用病毒去感染細胞而間接得到病毒的滴度，測量過程繁瑣，耗時長，且不同實驗者之間測得的結果相差較大.

隨著近年來流式細胞術(FCM)的不斷發(fā)展，其檢測范圍不再局限于細胞，它已廣泛應用于生物醫(yī)學的各個領域.Marie和Brussaard[6-7]等采用流式細胞儀通過特異性核酸熒光染料SYBR Green I染色成功地檢測并計數(shù)海洋病毒.在此基礎上，Shen[8]首次利用流式細胞術計數(shù)桿狀病毒，但染色效果不好.本實驗針對染色過程中的主要影響因素進行優(yōu)化，驗證了改進后方法的重復性和線性性，并對流式細胞術與終點稀釋法的計數(shù)結果進行比較.

1 實驗部分

1.1 病毒

野生型的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(wide type AcNPV)由武漢大學友好提供.

1.2 試劑及儀器

SYBR Green I(10 000×)和黃綠熒光微球(1μm)均購于Molecular Probes公司；多聚甲醛購于生工生物工程有限公司；Triton X-100購于Amresco公司；FACSCalibur流式細胞儀，BD公司生產(chǎn).

1.3 樣品制備

病毒樣品制備的主要步驟可分為固定、破膜和染色.待測病毒經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=8.0)稀釋后，加入一定量的多聚甲醛4 ℃下固定30 min，再放入-80 ℃超低溫冰箱15 min，然后置于室溫水浴中5 min，加入一定量的Triton X-100室溫放置5 min，最后加入SYBR Green I進行染色，具體的影響因素及水平如表1所示.在上機檢測之前，加入已知濃度的黃綠熒光微球作為內(nèi)參.

表1 病毒染色過程的影響因素及水平

1.4 流式細胞儀分析

采用BD公司FACSCalibur流式細胞儀檢測病毒樣品.前向散射光(FSC-H)、側向散射光(SSC-H)和綠色熒光(FL1-H)均以對數(shù)模式獲取.以FL1-H設定閾值，減少背景干擾.CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)，在SSC-H和FL1-H的雙參數(shù)散點圖上確定病毒和微球的位置(圖1).

圖1 SSC-H vs. FL1-H雙參數(shù)散點圖

“門”R1內(nèi)為加入的微球，“門”R2內(nèi)為待測的病毒.根據(jù)R1/R2可以推算出樣品病毒的滴度(1).

(1)

將得到的樣品病毒滴度乘以稀釋倍數(shù)便是原病毒樣本中的病毒滴度.

1.5 重復性和線性性檢測

線性性：PBS緩沖液稀釋桿狀病毒1000倍，取稀釋后不同體積(5～640 μL)的病毒測定其滴度，做3個重復，計算相關系數(shù)R2.重復性：對同一個病毒樣本計數(shù)8次，計算變異系數(shù)CV.

1.6 流式細胞術與終點稀釋法的計數(shù)結果比較

為了比較改進后的流式測量方法與傳統(tǒng)的病毒測定方法的準確性，采用終點稀釋法[4]對同一病毒樣本進行檢測，具體如下：a.將處于對數(shù)生長期的Sf9細胞接種于96孔板中(100 μL/孔)，27 ℃下孵育24 h.b.以新鮮培養(yǎng)基連續(xù)10倍稀釋桿狀病毒(10-4～10-10).c.96孔板去上清，于每孔加入不同稀釋度的病毒100 μL，每稀釋度重復12孔，對照孔加入100 μL的新鮮培養(yǎng)基代替病毒液，27 ℃下孵育5～7 d.d.按Spearman-Karber法[9]計算病毒樣本的TCID50值.重復測量5次，計算變異系數(shù)CV.

2 結果與討論

2.1 固定的影響

圖2顯示了不同質(zhì)量分數(shù)的多聚甲醛固定對桿狀病毒計數(shù)的影響.采用多聚甲醛固定能夠維持病毒的原有形態(tài)，提高病毒的計數(shù)，但當其質(zhì)量分數(shù)大于0.1%后病毒的計數(shù)隨之減少.這主要是由于甲醛與DNA的相互作用，削弱了染料SYBR Green I與DNA的結合.病毒顆粒的熒光強度也會隨著多聚甲醛質(zhì)量分數(shù)的增加而降低.

圖2 多聚甲醛固定的影響

注: 規(guī)定未經(jīng)固定處理的樣本熒光強度為1.

2.2 破膜處理

破膜的主要原理是利用驟冷驟熱或破膜劑的溶脂作用增強病毒顆粒的通透性，以便于染料的進入.從圖3(a)可知，病毒樣本經(jīng)過凍融處理后，熒光強度逐漸增強，但病毒計數(shù)卻隨之而減少，這可能是由于凍融導致一部分病毒的DNA與染料不能有效地結合.圖3(b)是Triton X-100終質(zhì)量分數(shù)為0.2%的直方圖，與圖1相比較可知：經(jīng)破膜劑處理后，病毒的熒光信號分散，背景噪音增強，導致兩峰交疊，不利于病毒的準確計數(shù).

(a)凍融處理的影響

(b)破膜劑處理的影響

Fig.3 Effects of permeabilization on baculovirus counts

注: 規(guī)定未經(jīng)凍融處理的樣本熒光強度為1.

2.3 染色溫度和時間的影響

孵育過程對病毒計數(shù)的影響顯著(圖4).孵育溫度的提高，一方面可以使病毒外殼失活，增強其通透性，另一方可以增強染料的活性，增加計數(shù)結果(圖4a)，但溫度過高對染色結果也不利.孵育時間不足，將導致染色不充分，病毒峰與背景峰交疊，不能準確計數(shù)，當孵育時間大于10 min后，計數(shù)結果保持穩(wěn)定(圖4b).

(a)孵育溫度的影響

(b)孵育時間的影響

Fig.4 Effects of incubation process on baculovirus counts

2.4 重復性和線性性檢測

對于重復性，8次實驗結果的平均值為1.22×1010病毒顆粒/mL，最大值為1.43×1010病毒顆粒/mL，最小值為1.01×1010病毒顆粒/mL，CV值為2.4%，這表明該方法的重復性較好.對于線性性，從圖5可知，病毒滴度在106～107病毒顆粒/mL范圍內(nèi)，線性性較好(R2=0.999 8).

圖5 不同加入體積的病毒計數(shù)

注：固定前所有樣本均加入PBS緩沖液稀釋至960 μL終體積.

2.5 流式細胞術與終點稀釋法的計數(shù)結果比較

分別采取流式細胞術和終點稀釋法測定同一批病毒的滴度，測量結果如表2所示.從表2可知，流式細胞術的重復性(CV=2.4%)明顯優(yōu)于終點稀釋法(CV=25.7%).表中流式細胞術的測量結果是終點稀釋法的13.7倍，這是因為流式細胞術是直接計數(shù)病毒，而終點稀釋法測量的是感染單位.一個感染單位對應多個病毒顆粒，所以流式測量結果大于終點稀釋法.

表2 終點稀釋法與流式細胞術測量結果的比較

3 結 語

病毒最佳染色條件：4 ℃下，0.1%的多聚甲醛固定病毒樣本30 min，然后加入SYBR Green I在80 ℃下避光染色10 min.經(jīng)改進后的流式細胞術測定桿狀病毒的方法能夠快速而準確的測定桿狀病毒的滴度.

參考文獻：

[1]Thomas A K, Condreay J P, Donald L J. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells[J]. Nat Biotechnol, 2005, 23(5): 567-575.

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[3]Zhang Y H, Enden G, Merchuk J C. Insect cells-Baculovirus system: Factors affecting growth and low MOI infection[J]. Biochem Eng J, 2005, 27(1): 8-16.

[4]O'Reilly D R, Miller L K, Luckow V A. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual[M]. New York: Oxford University Press, 1994: 132-134.

[5]Hink W F, Vail P V. A plaque assay for titration of Alfalfa looper nuclear polyhedrosis virus in cabbage looper (TN-368) cell line[J]. J Invertebr Pathol, 1973, 22: 168-174.

[6]Marie D, Brussaard C P D, Thyrhaug R, et al. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(1): 45-52.

[7]Brussaard C P D. Optimization of procedures for counting viruses by flow cytometry[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(3): 1506-1513.

[8]Shen C F, Meghrous J, Kamen A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry[J]. J Virol Methods, 2002, 105(2): 321-330.

[9]Fineey D J. Statistical Method in Biological Assay[M]. 3rd ed. London: Charles Griffin & Co., 1978: 394-401.