王鵬偉，史俊華

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5-氮胞苷和利福平對叢枝病泡桐幼苗形態(tài)和蛋白質(zhì)變化的協(xié)同影響

王鵬偉1，史俊華2

（1.信息工程大學(xué)信息工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所，鄭州 450002）

以感染叢枝病的豫雜一號泡桐幼苗為試驗材料，通過不同濃度5-氮胞苷和利福平處理，研究了其幼苗形態(tài)和蛋白質(zhì)的變化。結(jié)果表明，適宜濃度的利福平和5-氮胞苷共同使用可抑制泡桐叢枝病的發(fā)生。150 μmol·L-15-氮胞苷+80 mg·L-1利福平可以抑制豫雜一號泡桐叢枝病癥狀。存在于健康豫雜一號幼苗中的蛋白質(zhì)6.8、24ku而在病苗中觀察不到。表明該蛋白質(zhì)可能與豫雜一號泡桐叢枝病發(fā)生有一定關(guān)系。

泡桐叢枝病；5-氮胞苷；利福平；蛋白質(zhì)；雙向電泳

泡桐是我國重要的速生用材、出口木材和道路綠化樹種之一，但是，泡桐叢枝病的廣泛性和高發(fā)率嚴重制約和影響了泡桐的生產(chǎn)和發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者對泡桐叢枝病的發(fā)生機理和防治方法作了大量的研究工作[1~4，5~10，12~16]。研究表明，植原體是泡桐叢枝病發(fā)生的病原，植物植原體病害的化學(xué)治療主要采用抗生素治療。利福平作為細菌等微生物的遺傳物質(zhì)合成抑制劑，對泡桐叢枝病有消除病癥的作用[4]，然而，其濃度的選擇及和其他物質(zhì)的共同作用的研究較少，文章探討不同濃度5-氮胞苷（5-Azacytidine,5-Aza）和利福平（Rifampin）協(xié)同處理患叢枝病的豫雜一號泡桐組織培養(yǎng)苗，觀察5-氮胞苷、利福平對泡桐叢枝病外部形態(tài)發(fā)生的影響及對患叢枝病泡桐苗木蛋白質(zhì)變化的影響，為泡桐叢枝病的有效防治和發(fā)生機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所采用的材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐所林木生物技術(shù)實驗室保存的豫雜一號患叢枝病組培苗和健康組培苗，保存該組培苗的基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度5-氮胞苷和利福平對患叢枝病泡桐組織培養(yǎng)苗的形態(tài)影響

將在1/2MS培養(yǎng)基上保存的患叢枝病豫雜一號泡桐頂芽，分別接種到附加質(zhì)量濃度為0，50，100，150，200，250 μmol·L-15-Aza和利福平80，100，120mg·L-1NAA 0，0.3mg·L-1質(zhì)量濃度組合的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度為20 g·L-1，瓊脂為3.6 g·L-1，每瓶放4個頂芽，每個質(zhì)量濃度處理組合20瓶。于溫度為25℃±2℃的黑暗條件下培養(yǎng)7 d；在光照強度2 500 lx，光照時間16 h·d-1的條件下培養(yǎng)23 d。7 d后，每天觀察1次苗木生長情況， 30 d后統(tǒng)計結(jié)果，計算生根率、腋芽生長率，植株生根率和腋芽生長率的計算公式為：

葉片上出現(xiàn)剛毛的情況、葉片顏色和節(jié)間生長情況，各項觀察以肉眼可辨為標準（葉片上剛毛0~60%為較少，60%~80%為中等，80%~100%為較多；葉片大小平均小于0.5 cm2為較小，1 cm2為較大，介于兩者之間為中等）。苗木生長30 d以后，將外表呈現(xiàn)健康的組織培養(yǎng)苗剪取頂芽轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；并將經(jīng)過不同質(zhì)量濃度組合處理過的組織培養(yǎng)苗在低溫下提取出來，用液氮浸泡1~2 min，保存在-70℃冰箱中，備用。

1.2.2 蛋白質(zhì)雙向電泳

葉片蛋白質(zhì)干粉及蛋白質(zhì)樣品的制備和蛋白質(zhì)雙向電泳采用范國強等[2，3]試驗方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-氮胞苷、利福平對豫雜一號泡桐叢枝病幼苗形態(tài)變化的影響

從5-氮胞苷和利福平處理后苗木形態(tài)變化結(jié)果（圖1，表1）可以看出，不同濃度的5-氮胞苷和利福平組合對豫雜一號泡桐叢枝病幼苗的形態(tài)變化有很大影響。在利福平濃度相同的條件下，5-氮胞苷對叢枝病的好轉(zhuǎn)有一定的作用，并且過高或者過低濃度的5-氮胞苷都不利于癥狀的減輕或者消除；在利福平質(zhì)量濃度為80 mg·L-1的條件下，5-Aza濃度在0～50 μmol·L-1時，隨著5-Aza濃度的增高，患病幼苗長出第1條根所需時間逐漸變長，幼苗生根數(shù)量逐漸減少，腋芽生長率降低，但是腋芽長出時間沒有變，葉片均大且均有剛毛； 5-Aza濃度為100～200μmol·L-1時，幼芽生根顯著受到抑制，生根時間推遲明顯，幼苗生長過程中沒有叢生腋芽產(chǎn)生，頂芽不再膨大，幼苗葉片大小、葉片顏色、葉片上剛毛的數(shù)量沒有明顯區(qū)別；當(dāng)5-Aza濃度為250μmol·L-1時，幼苗在第26天又有腋芽長出，腋芽生長率為5%。這些結(jié)果表明，在利福平濃度相同的條件下，加入適宜濃度的5-Aza對患叢枝病泡桐體內(nèi)植原體的生長和繁殖有一定的抑制作用，其抑制作用大于單一使用利福平；較高或者較低濃度的5-氮胞苷都不利于叢枝病癥狀的減輕。150 μmol·L-1和200μmol·L-1這2個濃度的5-氮胞苷對于叢枝病癥狀的減輕較為明顯。并且5-氮胞苷對豫雜一號患叢枝病幼苗的生根具有抑制作用，隨著5-氮胞苷濃度的升高，生根時間依次延遲。當(dāng)利福平質(zhì)量濃度達到100 mg·L-1的時候開始，不管5-氮胞苷的質(zhì)量濃度如何，MS上的腋芽生長率都為0，在30天的培養(yǎng)期間均未見腋芽的產(chǎn)生，也沒有頂端膨大現(xiàn)象，并且所有組合的幼苗都密被剛毛，幼苗的莖干都很健壯。但是在生長到大約24天時，各組合的幼苗的葉片開始有枯黃或者脫落的現(xiàn)象，當(dāng)利福平質(zhì)量濃度達到120 mg·L-1的時候這種現(xiàn)象更加嚴重，而在1/2MS培養(yǎng)基上維持健康的時間最長，從利福平100 mg·L-1的40～57 d增加為70～72 d。說明利福平在抑制泡桐叢枝病方面作用大于5-氮胞苷，同時高濃度的利福平對泡桐生長的副作用也比較明顯。

圖1 豫雜一號泡桐叢枝病幼苗的形態(tài)變化

A.病苗；B. 200μmol·L-15-氮胞苷； C. 150 μmol·L-15-氮胞苷+80 mg·L-1利福平+0.9 mg·L-1NAA； D.健康苗（80利福平+50 μmol·L-15-Aza，80利福平+100 μmol·L-15-Aza， 100利福平+50 μmol·L-15-Aza，120利福平+50 μmol·L-15-Aza）

另一方面，在5-氮胞苷質(zhì)量濃度一定時，利福平的質(zhì)量濃度對泡桐叢枝病的減輕或者消除起著決定性的作用。當(dāng)5-氮胞苷濃度為50 μmol· L-1時，利福平質(zhì)量濃度為80 mg·L-1的條件下，第24天時培養(yǎng)基中有腋芽出現(xiàn)；利福平質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的條件下，幼苗生長過程中沒有叢生腋芽產(chǎn)生，維持健康的時間從MS基上的24天提高到了40天；利福平質(zhì)量濃度為120 mg·L-1的條件下，培養(yǎng)基中沒有腋芽出現(xiàn)，維持健康狀態(tài)的時間提高到了70天；當(dāng)5-氮胞苷質(zhì)量濃度為100～200 μmol·L-1時，培養(yǎng)基中沒有腋芽出現(xiàn)，這些組合全都呈現(xiàn)健康，隨著利福平質(zhì)量濃度的增加，維持健康的時間從MS基上的26天提高到了72天，但是幼苗的葉片開始有枯黃或者脫落的現(xiàn)象，組合間在形態(tài)上差異不明顯；當(dāng)5-氮胞苷質(zhì)量濃度為250 μmol·L-1時，利福平質(zhì)量濃度為80 mg·L-1的條件下，第26天時培養(yǎng)基中又有腋芽出現(xiàn)；利福平質(zhì)量濃度為100~120 mg·L-1的條件下，幼苗生長過程中沒有叢生腋芽產(chǎn)生，維持健康的時間依次提高。以上結(jié)果說明，利福平和5-氮胞苷在對植原體的抑制或消除上具有相互加強或是增強抑制作用的效果；利福平和5-氮胞苷濃度的最佳組合不是濃度越高越好。

表1 不同濃度5-氮胞苷、利福平處理后苗木形態(tài)變化

注： -表示沒有發(fā)病，*表示由于在處理時已經(jīng)發(fā)病，因此沒有在1/2MS培養(yǎng)基上接轉(zhuǎn)。

由以上分析可知，150 μmol·L-15-氮胞苷+80 mg·L-1利福平這種質(zhì)量濃度組合是治療泡桐叢枝病的最佳組合。

2.2 5-氮胞苷和利福平處理對叢枝病幼苗蛋白質(zhì)的影響

由5-氮胞苷和利福平對患叢枝病幼苗蛋白質(zhì)的雙向電泳結(jié)果（圖2）可以看出，不同濃度的5-氮胞苷利福平組合處理后，病苗葉片蛋白質(zhì)發(fā)生了較為明顯的變化。存在于健康豫雜一號幼苗中的蛋白質(zhì)6.8、24ku而在病苗中觀察不到[3，4]，我們在雙向電泳圖譜中（圖2：A～I）也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。5-氮胞苷0+利福平80 mg·L-1這一質(zhì)量濃度組合處理的病苗其形態(tài)呈現(xiàn)叢枝病癥狀，在其葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜中（圖2：H）觀察不到6.8、24ku蛋白質(zhì)；5-氮胞苷100 μmol·L-1+利福平80 mg·L-1這一質(zhì)量濃度組合處理的病苗其形態(tài)呈現(xiàn)無叢枝病癥狀，在其葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜中（圖2：B）出現(xiàn)了6.8、24ku蛋白質(zhì)；在其他的質(zhì)量濃度組合中，病苗形態(tài)呈現(xiàn)無叢枝病癥（表1），其幼苗葉片內(nèi)均出現(xiàn)了該蛋白質(zhì)（圖2： C、D、E、F、G）。此外，未處理患病幼苗葉片內(nèi)也沒有該蛋白質(zhì)的存在（圖2：A ），而在健康幼苗葉片內(nèi)存在該蛋白質(zhì)（圖2：I）。這表明一定質(zhì)量濃度的5-氮胞苷和利福平協(xié)同處理患病苗可誘導(dǎo)體內(nèi)6.8、24ku蛋白質(zhì)的重現(xiàn)。從而推測一定質(zhì)量濃度的5-氮胞苷和利福平協(xié)同處理可能清除患病幼苗體內(nèi)存在的植原體，使由于植原體干擾而導(dǎo)致降低或停滯合成該蛋白質(zhì)的基因重新激活，幼苗不呈現(xiàn)叢枝病癥狀[4]。

3 結(jié)論與討論

抗生素具有在極小的濃度下有選擇地抑制、促進或殺滅其他微生物和生物細胞的作用。利福平就是1種能夠抑制RNA的轉(zhuǎn)錄的抗生素。適宜濃度的利福平和5-氮胞苷共同使用可抑制泡桐叢枝病的發(fā)生。濃度為100 mg·L-1、120 mg·L-1的利福平對泡桐叢枝病的抑制具有明顯的效果，但造成苗木葉片枯黃或脫落。培養(yǎng)基中加入5-氮胞苷可以降低利福平的使用濃度。150 μmol·L-15-氮胞苷+80 mg·L-1利福平可以抑制豫雜一號泡桐叢枝病癥狀。范國強等（2006，2007）的研究結(jié)果表明抗生素可誘導(dǎo)病苗體內(nèi)6.8、24ku蛋白質(zhì)的重現(xiàn)。本試驗的一些研究結(jié)果也表明一定質(zhì)量濃度的5-氮胞苷和利福平協(xié)同處理患病苗可誘導(dǎo)體內(nèi)6.8、24ku蛋白質(zhì)的重現(xiàn)，可以消除病苗叢枝病的發(fā)生。存在于健康豫雜一號幼苗中的蛋白質(zhì)6.8、24ku而在病苗中觀察不到。表明該蛋白質(zhì)可能與豫雜一號泡桐叢枝病發(fā)生有一定關(guān)系。

圖2 5-氮胞苷和利福平處理后病苗葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜

A 病苗；B 5-氮胞苷100 μmol·L-1+利福平80 mg·L-1；C 5-氮胞苷200 μmol·L-1+利福平 80 mg·L-1； D 5-氮胞苷100 μmol·L-1+利福平100 mg·L-1；E 5-氮胞苷200 μmol·L-1+利福平 100 mg·L-1； F 5-氮胞苷100 μmol·L-1+利福平120 mg·L-1；G 5-氮胞苷200 μmol·L-1+利福平 120 mg·L-1H 5-氮胞苷0+利福平80 mg·L-1；I 健康

甲基化是活體細胞中1種最常見的DNA共價修飾形式，它對于控制基因表達、DNA復(fù)制及系統(tǒng)發(fā)育以及生物自身的保護、抵御外來基因組的干擾起著十分重要的作用。具體經(jīng)過5-氮胞苷處理后的苗木的總甲基化水平、以及甲基化位點是否變化，還有待于做進一步的研究。

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Effects of 5-Aza and Other Extraneous Substances on the Changes of Morphology and Protein ofSeedlings with witche’s Broom

WANGPeng-wei1，SHI Jun-hua2

（1.Information engineering university,Zhengzhou 450002, China; 2.Henan agricultural universityresearch institute,Zhengzhou 450002,China）

The paper take the seedlings ofinfected witche’s broom as the experiment material .Reaserch on the effect on the morphological and the preotin change that treated by different concentration of 5-Aza and rifampin. The main results are as following: Appropriate concentration of 5- Aza and rifampin can restrainwitche’s broom. Treament of 150 μmol·L-15- Aza+80 mg·L-1rifampin can restrainwitche’s broom. The protein (6.8、24ku) exist in the healthy seedlings can not be observed in the seedlings of witche’s broom. This indicate that the protein possibly has some realationship withwitche’s broom.

witche’s broom; 5-Azacytidine ; Rifampin ; Protein ; 2- D electrophoresis

S 763.1

A

1003-2630（2010）03-0004

2010-08-15

（責(zé)任編輯：王文彬）