田慧源，唐博希，王原秀，劉 帆，郭凱陽，劉國琴

(貴州大學(xué)煙草學(xué)院 / 貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實驗室，貴州 貴陽 550025)

煙草Nicotianatabacum是以葉片為主要收獲物的經(jīng)濟(jì)作物和潛在的生物能源，也是研究植物基本生物過程的重要模式植物[1]。在生長過程中，煙草的枝條結(jié)構(gòu)受頂端優(yōu)勢和發(fā)育過程的控制。通過去除頂端優(yōu)勢(在開花前去除花序)，腋芽迅速長成枝條，這會嚴(yán)重降低煙草經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量[2]。如何有效減少腋芽的產(chǎn)生從而提高煙葉產(chǎn)質(zhì)量仍然是如今煙葉生產(chǎn)中面臨的難題。因此，有必要了解煙草腋芽的生長機(jī)制，以制定抑制腋芽伸長的有效策略。在包括煙草在內(nèi)的多種植物中，腋芽的生長均始于植物葉腋處分生組織(Axillary meristerm，AM)的發(fā)育。從細(xì)胞學(xué)上看，在腋芽的生長過程中，其腋分生組織形態(tài)、細(xì)胞數(shù)量及體積在不同生育時期存在差異[3]。AM 發(fā)育形成腋芽后，可分為兩種發(fā)育情況：一種是由于頂端優(yōu)勢的存在或其他因素的影響，誘導(dǎo)腋芽休眠，使得腋芽進(jìn)入生長停滯狀態(tài)；第二種是腋芽持續(xù)生長發(fā)育形成側(cè)枝，在該生長發(fā)育過程中會受到遺傳因素、環(huán)境因素和植物激素的影響，其中植物激素對其生長發(fā)育發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[4]。植物激素是在植物體內(nèi)合成的一類微量信號分子，在低濃度下可以調(diào)控植物腋芽的生長發(fā)育[5]。吲哚乙酸(IAA)是最早被發(fā)現(xiàn)的植物激素，于頂芽或幼嫩組織中產(chǎn)生，并由植物頂端向植物基部進(jìn)行極性運(yùn)輸，在植物腋芽的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[6]。細(xì)胞分裂素(CTK)參與調(diào)控植物腋芽生長，在擬南芥Arabidopsisthaliana中，CTK 水平與腋芽生長速率正相關(guān)[7]。此外，油菜素內(nèi)酯(BR)作為一種重要的植物甾醇類激素，在調(diào)控植物腋芽生長方面同樣發(fā)揮著重要作用，能促進(jìn)腋芽生長[8]。但關(guān)于BR 對煙草腋芽生長的影響尚不清楚。獨(dú)腳金內(nèi)酯(Strigolactone，SL)是繼IAA、CTK、BR 之后發(fā)現(xiàn)的一類新型植物激素，參與植物生長發(fā)育并調(diào)控植物腋芽生長及分枝的形成[9]，在調(diào)控植物腋芽生長的過程中與BR 存在拮抗作用[10]。

GR24 是一種SL 生物合成類似物，能夠抑制植物腋芽生長[11]。TIS-108 作為SL 的生物合成抑制劑，能夠抑制水稻Oryzasativa內(nèi)源SL 的生物合成水平[12]。研究發(fā)現(xiàn)，SL 能夠抑制植物腋芽的生長[13]，其代謝途徑相關(guān)基因在SL 抑制腋芽伸長過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[14]。AtD27基因是SL 生物合成的正調(diào)控因子，能夠正調(diào)控SL 的生物合成[15]，與植物腋芽的生長密切相關(guān)[16]。D14為SL 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個正調(diào)控因子，編碼一種能使SL 釋放小分子活性的蛋白，在腋芽起始發(fā)育中發(fā)揮作用，能夠抑制植物分枝的形成[17]。DAD2作為水稻和擬南芥D14的同源基因，與D14具有相同的作用機(jī)制，能夠正調(diào)控SL 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。SMAX1/SMAX1-LIKE蛋白在SL 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮作用，SMAX1/SMAX1-LIKE 蛋白與MAX2 等因子進(jìn)行相互作用，以調(diào)節(jié)植物側(cè)枝的生長[19]。然而，關(guān)于SL 代謝途徑相關(guān)基因在煙草腋芽生長過程中的調(diào)控作用研究較少。

迄今為止，大多數(shù)關(guān)于植物腋芽生長的研究都是采用模式植物進(jìn)行，如菊花Chrysanthemum morifolium‘Jinba’[20]和 番 茄Solanum lycopersicum[21]，而對煙草的研究較少[22]。目前，關(guān)于SL 對煙草腋芽生長發(fā)育影響的研究主要集中在生理代謝方面[23]，少有參與SL 代謝途徑相關(guān)基因的研究。因此，本研究探究打頂后煙草腋芽的分生組織發(fā)育變化以及在SL 處理下煙株腋芽長度的變化，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組分析SL 生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)譜，采用qRT-PCR 技術(shù)分析煙草打頂后SL 相關(guān)基因在腋芽不同生長發(fā)育階段的表達(dá)模式變化，探討SL 相關(guān)基因與腋芽伸長的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為K326。

主要試劑：獨(dú)腳金內(nèi)酯人工合成類似物GR24(C17H14O5，分子量298.29，純度＞98%)購于上海翊圣生物科技有限公司；BR (C28H48O6，分子量490.68，純度＞98.05%)購于北京酷來博生物公司；SL 生物合成抑制劑TIS-108 (C20H21N3O2，分子量335.40，純度＞98%)購于北京索萊寶生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)

將煙草種子播種在12 孔育苗盤(長72 mm、寬49 mm、高62 mm)中，基質(zhì)為0.85 L 水，每個育苗孔種植1 株幼苗。幼苗盤置于晝夜平均溫度約26 ℃/17 ℃的人工氣候箱中培養(yǎng)。煙草幼苗長至五葉一心階段時，隨機(jī)選取生長一致的煙苗移栽到外口徑235 mm、高140 mm 的塑料花盆中培養(yǎng)，每盆基質(zhì)10 kg。煙苗移栽后，按照常規(guī)栽培措施進(jìn)行灌溉、施肥及病蟲害管理。

1.2.2 試驗設(shè)計

于2020 年6 月～2022 年9 月開展試驗。

試驗1：煙苗移栽14 d 后，選擇生長條件相同的煙株進(jìn)行打頂處理，將此時設(shè)為打頂0 h 并取樣，將頂端切口下方第一節(jié)位腋芽連同其葉柄完整取下，去除葉片。然后在打頂2、4、6、8、10、12 和14 h 分別進(jìn)行取樣作為其他處理，總共8 個處理，每處理5 個重復(fù)，9 株為一個重復(fù)，每處理45 株。

試驗2：煙株移栽50 d 后，選擇生長一致、無病蟲害的煙草植株進(jìn)行外源激素處理。處理1：打頂后不對腋芽部位施加任何外源激素；處理2：打頂后第0～6 d，于每日上午8 點(diǎn)在腋芽部位外源施加10 μmol·L-1GR24 溶液100 μL，每日處理一次；處理3：打頂后第0～6 d，于每日上午8 點(diǎn)外源施加10 μmol·L-1TIS-108 溶液100 μL；處理4：打頂后0～6 d，于每日上午8 點(diǎn)在植株的腋芽部位外源施加5 μmol·L-1BR 溶液100 μL。外源激素在使用前，將體積分?jǐn)?shù)0.2%吐溫20 加入到10 μmol·L-1GR24、BR 溶液和TIS-108 溶液中。每處理設(shè)3 個重復(fù)，每重復(fù)30 株。

1.2.3 腋芽長度測定

在激素處理0、2、4、6 d 時，用直尺測量植株頂端打頂切口下方的第1～3 節(jié)位的腋芽長度，并取3 個節(jié)位的腋芽-80 ℃保存。

1.2.4 腋分生組織發(fā)育解剖結(jié)構(gòu)觀察

采用常規(guī)石蠟切片方法研究煙草腋芽處的分生組織發(fā)育變化[3]。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組測序所用樣品為上述試驗2 中煙株打頂后0 d、2 d、6 d 時第1 至3 節(jié)位的混合腋芽。樣品總RNA 由Trizol 試劑進(jìn)行提取，RNA 的完整性和純度用Agilent 2100 RNA 6000 Nano 試劑盒進(jìn)行檢測[24]。轉(zhuǎn)錄組測序以 K326 全基因組(http://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome/Edward 2017)作為參考基因組。

1.2.6 實時熒光PCR

根據(jù)基因CDS 序列用Primer5 軟件設(shè)計引物(表1)。引物合成由重慶擎科生物科技公司完成。內(nèi)參基因是L25(基因庫登錄號L18908)[25]，反應(yīng)體系按照Talent qPCR PreMix (SYBR Green)說明進(jìn)行統(tǒng)一配置，檢測步驟由Bio-Rad CFX96 實時熒光定量PCR 儀完成。試驗共設(shè)置3 個技術(shù)重復(fù)，每個基因的相對表達(dá)量計算均采用2-△△CT方法[26]。

表1 用于表達(dá)分析的基因及其引物Table 1 Genes and their primers used in expression analysis

1.3 數(shù)據(jù)整理及圖表制作

運(yùn)用LSD 法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，利用TBtools、Figdraw 等進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草腋分生組織的發(fā)育變化

煙草腋分生組織由中央母細(xì)胞區(qū)(CM)、周緣分生組織(PM)和肋狀分生組織(RM)三個細(xì)胞區(qū)域組成(圖1)。CM 位于整個腋分生組織頂端，該區(qū)域細(xì)胞高度液泡化、細(xì)胞體積較大，CM 側(cè)面及基部的細(xì)胞可通過分裂產(chǎn)生PM 和RM。其中，PM 位于CM 兩側(cè)，細(xì)胞體積較小，細(xì)胞排列致密。RM 處于CM 的基部及PM 內(nèi)側(cè)的位置，該區(qū)域的細(xì)胞呈縱向排列(圖1)。煙草腋分生組織的細(xì)胞學(xué)分區(qū)主要反映分生組織中各部分細(xì)胞分裂的差異，PM 細(xì)胞分裂較CM 細(xì)胞快，因此從細(xì)胞體積上看，PM 細(xì)胞較CM 細(xì)胞小。

圖1 煙草打頂10 h 后腋分生組織結(jié)構(gòu)Fig. 1 Anatomical structure of tobacco axillary meristem at 10 h after decapitation

如圖2 所示，打頂0 h 時，腋分生組織中CM區(qū)域的細(xì)胞向側(cè)面和基部分裂，產(chǎn)生PM 的內(nèi)層及RM 組織(圖2 A)。打頂2 h 時，CM 區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞由1 層分裂成為7 層，初步形成腋芽原基(圖2 B)。4 h 后，CM 繼續(xù)進(jìn)行分裂，由于細(xì)胞分裂數(shù)量的增加，整個分生組織顏色加深(圖2 C)。6 h 時，CM 區(qū)域的細(xì)胞體積增大，PM、CM 區(qū)域細(xì)胞數(shù)量增加明顯(圖2 D)。8 h～14 h 時，PM 區(qū)域的細(xì)胞均向葉腋處兩側(cè)繼續(xù)分裂，促進(jìn)葉原基發(fā)育，RM 縱向分裂促進(jìn)腋芽原基徑向生長，促進(jìn)腋芽的伸長(圖2 E～H)，腋芽原基發(fā)育形成芽狀。

圖2 煙草K326 打頂后腋分生組織的發(fā)育變化Fig. 2 The dynamics of axillary meristem of Nicotiana tabacum K326 after decapitation

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對煙草腋芽伸長的影響

打頂后，腋芽長度增加，其中第1 節(jié)位的腋芽長度增長量最大，其次為第2 節(jié)位和第3 節(jié)位。處理6 d，第1～3 節(jié)位腋芽伸長量達(dá)到最大值(圖3)。說明打頂能夠促進(jìn)煙草腋芽的伸長，尤其在處理6 d時增幅最大。

圖3 GR24 和TIS-108 對煙草不同節(jié)位腋芽伸長的影響Fig. 3 The effects of GR24 and TIS-108 on the elongation of tobacco axillary buds in the section different position

不同植物生長調(diào)節(jié)劑(BR、GR24、TIS-108)對煙草腋芽長度的影響不同(圖3)。在BR 處理中，第1～3 節(jié)位中的腋芽長度均保持在較高水平，在處理2 d 時顯著高于CK、GR24 和TIS-108 處理，而在BR 處理4 d 時，第1～2 節(jié)位的腋芽長度與CK、TIS-108 處理無顯著差異；TIS-108 處理與CK、BR、GR24 處理相比，第3 節(jié)位的腋芽在處理4 d 和6 d時長度顯著增加；GR24 處理后，第1～2 節(jié)位腋芽長度的增長在處理2 d 時受抑制，與CK 和BR 處理差異顯著，尤其在第2 節(jié)位中腋芽長度的降幅最大，較CK 和BR 處理分別下降52%和69.2%(圖3)?？梢姡琒Ls 能夠抑制煙草腋芽的伸長，且同一生長階段不同節(jié)位煙草腋芽對GR24 的響應(yīng)存在差異，而BR 與GR24 的作用效應(yīng)相反，能夠促進(jìn)腋芽的伸長。

2.3 SL 生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄組分析

在SL 的生物合成過程中，異素異構(gòu)酶 D27 把a(bǔ)ll-trans-β-類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為9-cis-β-類胡蘿卜素，而后由CCD7 (MAX3)將9-cis-β-類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為9-cis-β-apo-10′-類胡蘿卜醛，CCD8 (MAX4)催化該物質(zhì)轉(zhuǎn)化為己內(nèi)酯(Carlactone, CL)，通過P450 等酶的催化作用，最終形成SL 進(jìn)入SL 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[27]。此時，D14 與F-box 蛋白MAX2、SMXLs 形成SCF復(fù)合體，該復(fù)合體存在開放式的空腔來容納SL，受到刺激后，可將SL 水解為小分子活性物質(zhì)CLIM(Covalently linked inter mediate molecule)，進(jìn)而激活SL 的信號傳導(dǎo)，促進(jìn)D53 降解，最終抑制植物分枝的生長[28]。

通過序列比對和注釋參考發(fā)現(xiàn)了12 個與獨(dú)腳金內(nèi)酯相關(guān)的差異基因，其中D27、CCD7、CCD8基因與獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成有關(guān)，D14、DAD2和SMAX1、SMAX1-LIKE4、SMAX1-LIKE6基因與獨(dú)腳金內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)(表2)。在處理2～6 d 時，在CK 和 GR (GR24)比較組中，CCD7(Nitab4.5_0003110g0040)、D27(Nitab4.5_0002828g0040)、DAD2(Nitab4.5_0000164g008) 、D14(Nitab4.5_0000279g0060)、SMAX1-LIKE4(Nitab4.5_0000056g 0010)呈上調(diào)表達(dá)，而SMAX1(Nitab4.5_0000244g 0070)的表達(dá)模式相反，呈下調(diào)表達(dá)。其中，CCD7(Nitab4.5_0003110g0040)的表達(dá)量上調(diào) 0.95～1.60倍，D27(Nitab4.5_0002828g0040)上調(diào)0.36～0.60倍，DAD2的表達(dá)量增加0.47～1.84 倍。在TIS(TIS-108) 與 GR24 比較組中，D27、D14僅在處理2 d 上調(diào)表達(dá)，DAD2僅在處理6 d 受到GR24 的誘導(dǎo)，而SMAX1-LIKE4在處理2～6 d 上調(diào)表達(dá)。CCD8(Nitab4.5_0001894g0040)和另一個CCD7基因(Nitab4.5_0004415g0050)的表達(dá)在兩組間無顯著變化?？梢奡L 影響煙草腋芽的伸長可能是通過調(diào)控其代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)來實現(xiàn)的(圖4)。

圖4 SL 生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在煙草腋芽中的表達(dá)譜Fig. 4 Expression profiles of strigolactone biosynthesis and signal transduction genes in tobacco axillary buds

表2 獨(dú)腳金內(nèi)酯合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因篩選與功能注釋Table 2 Screening and functional annotation of genes related to strigolactone synthesis and signal transduction

2.4 SL 代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)驗證

2.4.1 SL 相關(guān)基因在煙草腋芽生長過程中的表達(dá)變化

qRT-PCR 結(jié)果顯示，在CK 中，打頂后，腋芽伸長過程中D27、DAD2、D14、SMAX1-LIKE4的相對表達(dá)量在處理2～6 d 均保持在低水平，顯著低于GR24 和TIS-108 處理；相反，SMAX1基因呈高表達(dá)，在打頂2～4 d 均顯著高于GR24 處理(圖5)。GR24 處理后，與CK 和TIS-108 相比，D14、SMAX1-LIKE4基因的表達(dá)在處理2 d 受到GR24 的誘導(dǎo)，D27和DAD2在處理4 d 時高表達(dá)，而SMAX1在GR24 處理中低表達(dá)。在TIS-108 處理中，D14、DAD2、SMAX1-LIKE4和SMAX1的相對表達(dá)量與CK 之間無顯著差異。說明D27、DAD2、D14、SMAX1-LIKE4基因可能在響應(yīng)SL 抑制煙草腋芽伸長的過程中發(fā)揮正調(diào)控的作用，而SMAX1可能正調(diào)控?zé)煵菀秆康纳扉L(圖5 A～E)。

圖5 GR24 和TIS-108 處理下SL 代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)與qRT-PCR 驗證Fig. 5 Expression and qRT-PCR validation of SL metabolic pathway-related genes under GR24 and TIS-108 treatments

2.4.2 qRT-PCR 與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析

隨機(jī)挑選5個參與SL生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因進(jìn)行qRT-PCR 驗證，引物序列詳見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因的表達(dá)模式高度符合RNA-Seq 結(jié)果，相關(guān)系數(shù)(R2)＞0.91 (圖5 F～I(xiàn))，從而驗證了RNA-Seq 結(jié)果的可靠性。

3 結(jié)論與討論

研究表明，馬尾松Pinusmassoniana腋芽分生組織由中央母細(xì)胞區(qū)(CM)、周緣分生組織(PM)和肋狀分生組織(RM)組成[29]，本研究發(fā)現(xiàn)煙草腋芽的分生組織細(xì)胞區(qū)域與之相似。CM 位于腋分生組織的頂端，CM 細(xì)胞向下和兩側(cè)進(jìn)行分裂產(chǎn)生PM 和RM，即CM 是產(chǎn)生所有組織的原細(xì)胞[30]。腋分生組織三個區(qū)域的細(xì)胞體積、排列形式存在差異，CM 細(xì)胞高度液泡化，細(xì)胞體積較大，而PM 細(xì)胞體積較小、排列致密，RM 細(xì)胞呈縱向分布。細(xì)胞的形態(tài)和排列方式影響其分裂特性，煙草腋芽分生組織的細(xì)胞學(xué)分區(qū)實際上是反映了腋分生組織中各部分細(xì)胞分裂的差異性，PM 細(xì)胞體積較CM 小，說明PM 細(xì)胞分裂比CM 快[3]。打頂后，腋分生組織分裂迅速，K236 的腋分生組織在打頂0～4 h 后細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而木本植物在打頂4 h 后其腋分生組織細(xì)胞數(shù)量才開始增加，這可能是受物種特異性的影響[30]。

腋芽是植物株型的重要構(gòu)成元素之一，在多種影響腋芽生長發(fā)育的因素中，除了受自身發(fā)育的影響(腋分生組織的發(fā)育)，植物激素也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[31]。GR24 是應(yīng)用最廣泛的SL 合成類似物，具有與內(nèi)源性SL 相似的生物活性[32]，可以抑制各種植物的腋芽生長[33]。GR24 對各種植物影響的研究主要集中在側(cè)芽休眠上[34—35]、腋芽的萌發(fā)和生長[36]、芽分枝[37]或分蘗的形成與發(fā)育[36]。本研究更多地關(guān)注GR24 對腋芽伸長的影響。在第一節(jié)位的腋芽中，當(dāng)不同生長調(diào)節(jié)劑處理6 d 后，與CK、BR 和TIS-108處理植株相比，GR24 處理植株的腋芽伸長率顯著降低。研究表明 GR2 4 也能抑制擬南芥和豌豆Pisumsativum腋芽的生長和發(fā)育[38—39]，這與本研究結(jié)果一致，說明GR24 能夠抑制煙草腋芽的伸長。然而，腋芽在生長發(fā)育過程中，并不是受單一植物激素的影響，不同植物生長調(diào)節(jié)劑對腋芽生長的影響不同。TIS-108 對煙草腋芽生長的影響與SL 相反，與CK、BR、GR24 處理相比，在TIS-108 處理4 d和6 d 時，觀察到第3 節(jié)位的腋芽長度顯著增加，說明TIS-108 作為SL 合成抑制劑[10]，可與P450s血紅蛋白結(jié)合，如MAX1 酶(SL 生物合成酶)，從而影響SL 代謝水平，削弱SL 對腋芽的抑制效應(yīng)[10]。BR 作為一種重要的參與調(diào)控植物腋芽生長的植物激素，能夠促進(jìn)擬南芥和番茄腋芽的生長與側(cè)枝的形成[40—41]。在本研究中，與CK、GR24、TIS-108處理相比，BR 處理2 d 時，煙草第1～3 節(jié)位腋芽的長度顯著增加，說明BR 能促進(jìn)煙草腋芽伸長，在共同調(diào)控?zé)煵菀秆可扉L的過程中，與SL 之間可能存在一定的拮抗作用[42]。在煙草腋芽生長過程中SL與BR、TIS-108 之間的互作機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

相關(guān)研究表明，SL 調(diào)控腋芽生長過程中，其代謝途徑相關(guān)基因發(fā)揮著重要的作用[12]。D27 是SL生物合成的關(guān)鍵酶，定位于植物葉綠體中，其同系物為MAX3 和MAX1/D10[43—45]。擬南芥和豌豆的D27突變體由于SL 生物合成缺陷而表現(xiàn)出高分枝表型，但通過外源施加SL 后，該高分枝表型得以抑制[46—47]，D27可通過MAX/RMS/D途徑調(diào)控水稻的分蘗，并促進(jìn)分蘗中SL 的生物合成[48]。在本研究中，外源SL 可誘導(dǎo)煙草腋芽中SL 生物合成基因D27在處理4 d 時高表達(dá)，表明D27(Nitab4.5_0002828g0040)在SL 介導(dǎo)的抑制煙草腋芽伸長的過程中也發(fā)揮著正調(diào)控的作用[49]，但其對煙草腋芽的具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

D14 和DAD2 是F-box 蛋白(MAX2)家族的成員[50]，在SL 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。D14突變體植株較野生植株的高度顯著增加，同時呈現(xiàn)出高分蘗的表型，其表型類似于D3、HTD1/D17和D10突變體[51]。DAD2 是D14 的同系物，最早在牽?；≒harbitisnil中鑒定出來，其突變體與D14突變體相似，具有高分枝表型，證實D14/DAD2在SL途徑中起作用[52]，并抑制腋芽的生長[53]。在本研究中，煙株打頂后，SL 分別在處理2～4 d 時顯著誘導(dǎo)了D14(Nitab4.5_0000279g0060)與DAD2(Nitab4.5_0000164g0080)在腋芽中的表達(dá)，說明在煙草腋芽的生長過程中，D14與DAD2可能在SL 抑制煙草腋芽生長過程中發(fā)揮正調(diào)控作用，但具體的分子作用機(jī)制尚不清楚。SMAX1及其同源基因SMAX1-LIKE4(SMAXL 蛋白)在SL 信號通路的下游發(fā)揮阻礙因子的作用。在SL 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上游中，D14 與D3 形成SCF 復(fù)合物，該復(fù)合物靶向識別下游的SMAXLs蛋白導(dǎo)致其降解，從而啟動SL 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[54]。研究表明，SMAX1還參與植物側(cè)枝的調(diào)控[55]。擬南芥SMAX1通過改變TCP1和BRC1的表達(dá)來調(diào)控植物成熟期的葉片形態(tài)和枝條分枝[55]。在本研究中，SMAX1的表達(dá)受到GR24 抑制，而其同源基因SMAX1-LIKE4在腋芽不同生長發(fā)育時期出現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)，說明SMAX1(Nitab4.5_0000244g 0070)和SMAX1-LIKE4(Nitab4.5_0000056g0010)雖然為同源基因，但對SL 的響應(yīng)不同，可見，SMAX1(Nitab4.5_0000244g0070)可能在SL 抑制煙草腋芽生長過程中發(fā)揮著正調(diào)控的作用，其同源基因SMAX1-LIKE4(Nitab4.5_0000056g0010)可能負(fù)調(diào)控?zé)煵菀秆康纳L，但在煙草腋芽生長過程中該類基因具體的分子調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[56]。

綜上所述，煙草腋芽的生長除了受自身分生組織發(fā)育的影響，還受植物激素的調(diào)控，不同的植物生長調(diào)節(jié)劑對煙草腋芽生長的影響不同，BR 促進(jìn)煙草腋芽的伸長，而SL 抑制煙草腋芽的伸長，且在其參與調(diào)控腋芽生長的過程中，SL 代謝途徑相關(guān)的基因(D27、D14、DAD2、SMAX1、SMAX1-LIKE4)發(fā)揮著重要的作用。