胡庭俊,何彩美,鐘 晶

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005)

雞血藤不同極性段提取物制備及體外抑菌作用初步研究*

胡庭俊,何彩美,鐘 晶

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005)

采用水、丙酮和乙醇等不同極性溶劑對(duì)雞血藤有效成分進(jìn)行提取,測(cè)定了雞血藤不同極性段提取物對(duì)雞大腸埃希菌、鴨大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌等常見病原菌的體外抑菌效果。結(jié)果表明,雞血藤的各種提取物對(duì)雞大腸埃希菌的抑菌圈直徑均小于13 mm,屬低度敏感;對(duì)鴨大腸埃希菌有較好的抑制作用,屬中度敏感,其抑菌圈直徑大于13 mm,小于19 mm;對(duì)金黃色葡萄球菌為高度敏感,其抑菌圈直徑在19 mm以上。雞血藤微波提取物對(duì)雞大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng),700 mL/L乙醇提取物對(duì)鴨大腸埃希菌的抑菌作用最強(qiáng),最小抑菌濃度均為15.63 mg/mL。

雞血藤;提取物;體外抑菌;最小抑菌濃度

雞血藤為豆科植物密花豆的干燥藤莖[1]。雞血藤為傳統(tǒng)中藥,具有補(bǔ)血活血、舒筋活絡(luò)的功能,其化學(xué)成分復(fù)雜,具有廣泛的藥理作用。臨床上常用雞血藤或與其他藥物組方治療各種原因引起的白細(xì)胞減少癥、再生障礙性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜、急性腸炎、坐骨神經(jīng)痛、頸椎病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及各型紅斑狼瘡、乳腺囊性增生等,均取得了較好的效果[2]。雞血藤主要含有異黃酮類如芒柄花素、芒柄花苷、卡亞寧等[3]。據(jù)報(bào)道,黃酮類化合物具有高效、低毒的抗腫瘤活性,但人們對(duì)雞血藤中大多數(shù)黃酮類化合物的藥理活性知之甚少[4-5]。本試驗(yàn)采用不同極性溶劑獲得雞血藤不同極性段提取物,并進(jìn)行了雞血藤提取物體外抑菌試驗(yàn)的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

雞血藤、青霉素、鏈霉素購自南寧市太華醫(yī)藥公司;雞大腸埃希菌,鴨大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供;儀器設(shè)備主要有中藥材粉碎機(jī),恒溫水浴鍋,電子天平,燒瓶,培養(yǎng)皿,離心機(jī),恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 雞血藤提取物的制備

1.2.1.1 水提取物 將雞血藤用中藥粉碎機(jī)磨成粉狀。稱取雞血藤粉末20 g,加水煎煮3次,每次90 min。分別過濾,合并 3次濾液。將濾液以3 000 r/min離心30 min,上清液蒸發(fā)濃縮(100℃水浴)至 20 mL(濃度 1 g/mL)。115℃高壓滅菌15 min,置-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 微波提取物 將雞血藤用中藥粉碎機(jī)磨成粉狀。稱取雞血藤粉末20 g,加入200 mL蒸餾水,置于微波樣品處理系統(tǒng),于100℃處理15 min。將所得的提取液3 000 r/min,離心30 min,棄沉渣。上清液蒸發(fā)濃縮(100℃水浴)為 20 mL(濃度1 g/mL)。115℃高壓滅菌15 min,置-4℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.1.3 水煎醇提物 稱取雞血藤粉末20 g,加水煎煮3次,每次90 min。分別過濾,合并3次濾液。將濾液以3 000 r/min,離心30 min,棄去沉渣。上清液蒸發(fā)濃縮(100℃水浴)至 60 mL。加入950 mL/L乙醇進(jìn)行醇沉,使乙醇含量為800 mL/L,靜置24 h。過濾,濾液以3 000 r/min,離心30 min。上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇。乙醇回收基本完全時(shí),用蒸餾水定容至20 mL混懸液(濃度1 g/mL)。115℃高壓滅菌15 min,置-4℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.1.4 丙酮提取物 稱取雞血藤粉末20 g,用600 mL/L丙酮浸提3次(每次加入丙酮200 mL),提取間隔時(shí)間為48、24、24 h。合并 3次的浸提液,用3層紗布過濾。濾液3 000 r/min離心30 min,棄沉渣。上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收丙酮。丙酮回收基本完全時(shí),用蒸餾水定容至20 mL混懸液(濃度1 g/mL)。115℃高壓滅菌15 min,置-4℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.1.5 乙醇分級(jí)提取 參照文獻(xiàn)[6],稱取雞血藤粉末3份,每份20 g,分別用950,700,450 mL/L的乙醇溶液浸提 3次(每次加入相應(yīng) 950,700,450 mL/L的乙醇溶液200 mL),提取時(shí)間分別為48,24,24 h。合并3次的浸提液,用3層紗布過濾。濾液3 000 r/min離心30 min,棄沉渣。上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇。乙醇回收基本完全時(shí),用蒸餾水定容至20 mL混懸液(濃度1 g/mL)。115℃高壓滅菌15 min,置-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.6 雞血藤中黃酮類定性鑒定

(1)醋酸鎂試驗(yàn)(10 g/L醋酸鎂甲醇溶液)。將供試樣品液點(diǎn)于濾紙上,噴10 g/L醋酸鎂甲醇溶液,加熱干燥后,在紫外燈下觀察,二氫黃酮顯天藍(lán)色熒光,黃酮,異黃酮類則顯黃色→橙色→褐色。稱取少量固體樣品于試管中,加入甲醇1 mL～2 mL,在水浴中加熱溶解,加10 g/L醋酸鎂甲醇溶液試劑2滴～3滴,呈顏色反應(yīng)[7]。

(2)鹽酸鋅粉反應(yīng)。取樣品(固體)少許于試管中,加50 mL/L乙醇 2 mL,在水浴中加熱溶解,滴加濃鹽酸數(shù)滴,再加鋅粉約50 mg,在泡沫處呈桃紅色則表明含有黃酮?；蛉∷? mL～4 mL,在蒸發(fā)皿中蒸干,再加950 mL/L乙醇1 mL,加熱溶解,不溶物不用過濾,在試管中加入鋅粉適量(約50 mg),再加入濃鹽酸數(shù)滴,在泡沫處呈桃紅色即為陽性。

(3)濃氨水試驗(yàn)。將樣品點(diǎn)于濾紙上在濃氨水瓶口上熏,立即顯熒光,燈下產(chǎn)生極明顯的黃色熒光斑點(diǎn),即含黃酮類。

1.2.2 雞血藤各種提取物體外抑菌試驗(yàn)

1.2.2.1 培養(yǎng)基準(zhǔn)備 營養(yǎng)瓊脂平皿和營養(yǎng)肉湯按常規(guī)方法制備。

1.2.2.2 菌液的制備 將保存的菌種先接種營養(yǎng)瓊脂平板,于37℃培養(yǎng)24 h。(甲)用麥?zhǔn)媳葷峁芊?將細(xì)菌稀釋為3億個(gè)/mL的備用菌液;(乙)將細(xì)菌接種于牛肉湯中,于37℃培養(yǎng)18 h后,備用。

1.2.2.3 雞血藤提取物藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法[8]。在制作好的營養(yǎng)瓊脂平皿的底面用蠟筆劃出6個(gè)等區(qū),然后用滅菌棉簽蘸取(甲)備用菌液在瓊脂表面均勻涂布。用滅菌小鑷子取紙片浸入藥液中,使其充分浸透后取出,然后將紙片對(duì)號(hào)貼在平皿劃區(qū)的中央。每種藥液重復(fù)做3次,最后將平皿倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h～18 h后取出,量取抑菌圈直徑。求出每種藥液抑菌圈直徑的平均值。其結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑D≤8為不敏感,8 mm＜D≤13 mm的為低度敏感,13 mm＜D≤19 mm為中度敏感,D＞19 mm為高度敏感。

1.2.2.4 雞血藤提取物最小抑菌濃度MIC的測(cè)定 取滅菌試管10支并編號(hào),按1～10的編號(hào)排列于試管架上,按無菌操作要求分別加入牛肉湯0.5 mL。用吸管吸取藥液(1 g/mL)0.5 mL放入第1管,并反復(fù)吹勻。從第1管吸取0.5 mL放入第2管,同樣吹勻后吸出0.5 mL,放入第3管。依此法逐管進(jìn)行稀釋至第9管,第10管不加藥液作為對(duì)照管。各管均加入(乙)備用菌液0.5 mL,放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。細(xì)菌不生長(zhǎng)的最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果

2.1 雞血藤中黃酮類定性鑒定結(jié)果

依據(jù)3項(xiàng)定性試驗(yàn)結(jié)果綜合分析表明,雞血藤各種極性提取物中均含有黃酮類物質(zhì),水煎醇提物、600 g/L丙酮提取物、950 mL/L乙醇提取物和700 mL/L乙醇提取物黃酮類呈陽性,水提取物、微波提取物、450 mL/L乙醇提取物中黃酮類呈弱陽性(表1)。

表1 雞血藤中黃酮類定性鑒定結(jié)果Table 1 Identification of flavonoids in extracts of Reticulate millettia

2.2 雞血藤提取物藥敏試驗(yàn)結(jié)果

以鏈霉素、青霉素為對(duì)照藥物,測(cè)定了雞血藤的各種提取物分別對(duì)雞大腸埃希菌、鴨大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果(表2)。

結(jié)果表明,雞血藤各種提取物對(duì)雞大腸埃希菌的抑菌圈均小于13 mm,屬低度敏感;對(duì)鴨大腸埃希菌有較好的抑制作用,屬中度敏感,且不同溶劑提取物的抑菌作用不同;對(duì)金黃色葡萄球菌為高度敏感,大多數(shù)抑菌圈直徑在19 mm以上。與對(duì)照藥物比較,雞血藤的各種提取物的抑菌效果均低于鏈霉素、青霉素的抑菌效果。

2.3 雞血藤提取物最小抑菌濃度(MIC)

測(cè)定了雞血藤的各種提取物分別對(duì)雞大腸埃希菌、鴨大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(表3)。結(jié)果表明雞血藤的各種提取物對(duì)雞大腸埃希菌、鴨大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果。雞血藤微波提取物對(duì)雞大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用最好。雞血藤700 g/L乙醇提取物對(duì)鴨大腸埃希菌的抑菌作用最好,最小抑菌濃度都為15.63 mg/mL。

表2 雞血藤提取物體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 2 T he antibacterial activity of ex tracts of Reticulate millettia in vitro

表3 雞血藤提取物最小抑菌濃度MIC的測(cè)定Table 3 The MIC determination of extracts of Reticulate millettia in vitro

3 討論

雞血藤有效成分以異黃酮類如芒柄花素,芒柄花苷,卡亞寧及毛蕊異黃酮等為主[9]。本試驗(yàn)采用水提取法、水提醇沉法、950、700 、450 mL/L乙醇梯度提取法、600 mL/L丙酮提取法和微波提取法,獲得了雞血藤不同極性段提取物。水是中藥提取中常用提取溶劑,中藥中的生物堿類、苷類、有機(jī)酸類、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖類和無機(jī)鹽都能用水提出,且提取成本低、速度快,但水提取物所含成分復(fù)雜多樣,不易把握,而且不易分離。乙醇是生物堿、苷類、揮發(fā)油、內(nèi)酯、樹脂、鞣質(zhì)、有機(jī)酸和葉綠素等成分的良好溶劑,較水提取液不易發(fā)霉、變質(zhì),回收濃縮比較方便,容易處理,但所提取出成分與乙醇濃度有很大關(guān)系。950 mL/L乙醇作為溶劑提取出的成分主要是生物堿類、揮發(fā)油、樹脂和葉綠素;600 mL/L～700 mL/L的乙醇適用于苷類的提取;400 mL/L～500 mL/L的乙醇提取的主要是強(qiáng)心苷類及鞣質(zhì);200 mL/L～300 mL/L的乙醇則適用于蒽醌及苷類的提取。丙酮作為有機(jī)溶劑,也常用于藥物有效成分的提取。從雞血藤提取物中黃酮類定性鑒定結(jié)果來看,不同溶劑對(duì)其黃酮類成分的溶解存在一定的差異,雞血藤水提醇沉提取物、700 mL/L乙醇提取物及600 mL/L丙酮提取物中含黃酮類較其他提取物多。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,雞血藤的各種提取物對(duì)雞大腸埃希菌均具有一定的抑制作用;對(duì)鴨大腸埃希菌有較強(qiáng)的抑制作用,且不同溶劑提取物的抑菌作用有差異;雞血藤的各種提取物對(duì)金黃色葡萄球菌為高度敏感。雞致病性大腸埃希菌引起的大腸埃希菌病是影響?zhàn)B雞業(yè)生產(chǎn)的常見疾病之一[10],金黃色葡萄球菌是目前引起畜禽上呼吸道感染的常見病原菌[11-12]。在臨床上,抗生素的廣泛使用和濫用加速了菌株對(duì)藥物耐藥性的產(chǎn)生,造成用藥劑量越來越大,治療成本增加,而且還引起藥物殘留。尋找新的抗菌藥物是解決細(xì)菌耐藥性問題的重要途徑[13]。中藥具有毒副作用小、藥物殘留低、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行合理地開發(fā)和利用具有重要意義和廣闊應(yīng)用前景。雞血藤提取物含天然植物抗菌活性成分,提取雞血藤有效成分,開發(fā)為新一代的中藥抗菌產(chǎn)品,將會(huì)有廣闊的市場(chǎng)前景。

[1]中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006:193.

[2]韋 麟,潘炳堂,黃禮周,等.雞血藤臨床應(yīng)用概述[J].中國民間療法,2007,15(5):63-64.

[3]崔艷君,劉 屏,陳若蕓.雞血藤的化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,37(10):784-787.

[4]Lambert J D,Hong J,Yang G Y,et al.Inhibition of carcinogenesis by polyphenols:evidence from labo ratory investigations[J].Am J Clin Nutr,2005,81:284S-291S.

[5]唐 勇,何 薇,王玉芝,等.雞血藤黃酮類組分抗腫瘤活性研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2007,13(2):51-54.

[6]胡庭俊,溫日清,趙靈穎.連翹不同極性段提取物制備及體外抑菌作用初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(3):268-269.

[7]李醫(yī)明.中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:科學(xué)出版社,2009:58-59.

[8]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2002:35-37.

[9]崔艷君,陳若蕓.雞血藤化學(xué)和藥理研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2002:15(4):72-78.

[10]丁紅雷,王豪舉,楊紅軍.雞大腸桿菌病病原的分離鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(8):111-113.

[11]樊 杰.金黃色葡萄球菌氟喹諾酮的耐藥抑制劑研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(3):47-50.

[12]楊海燕,張傳美,吳金鳳.七種中藥對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑制試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(8):48-51.

[13]葉賀佳,葉萬樹,黃東璋.細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)理及其控制對(duì)策[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(10):33-38.

Preparation and Anti-bacterial Activities of Extracts fromReticulate millettia

H U Ting-jun,HE Cai-mei,ZHONG Jing

(College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530005,China)

Water,acetone or different concentrations of alcohol were used to extract different dissolvent ofReticulate millettia.The bacterial grow th inhibition testin vitrowas performed to evaluate bacteriostasis of the seven kinds of extracts.The result showed that the seven kinds of extracts revealed weak anti-bacterial activities on chickenEscherichia coliwith the diameters of inhibition zone less than 13 mm.T he seven kinds of extracts had significantly antibacterial actions on duckE.coliwith the bacteriostasis circle diameters between 13 mm and 19 mm.The most of seven kinds of extracts had significantly antibacterial actions onStaphylococcus aureuswith the bacteriostasis circle diameters larger than 19 mm.The extracts by microwave method had better antibacterial activities onStaphylococcus aureusthan other extracts.The extracts by 70%alcohol revealed the best antibacterial activity with minimum inhibitory concentration of 15.63 mg/mL.

Reticulate millettia;extracts;antibacterial activityin vitro;minimum inhibitory concetration

S853.1

A

1007-5038(2010)09-0033-04

2010-01-15

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科攻0992014-6);廣西“新世紀(jì)十百千人才工程”專項(xiàng)資金項(xiàng)目;廣西大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(X071026)

胡庭俊(1965-),男,甘肅蘭州人,教授,博士,主要從事中獸藥研究。