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      細(xì)胞固定劑對(duì)GFP發(fā)光特性影響的研究

      2010-06-06 01:00:36張廣峰陳祥貴帥培強(qiáng)
      化學(xué)與生物工程 2010年12期
      關(guān)鍵詞:多聚甲醛冰醋酸丙酮

      張廣峰,陳祥貴,帥培強(qiáng),林 琳

      (1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院,四川 成都 610039;2.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局,四川 成都 610041)

      綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP),是生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的標(biāo)記蛋白,常以融合蛋白的形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá),以觀察目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的移動(dòng)和定位。

      在很多研究中,需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定以便進(jìn)行后續(xù)的顯微觀察、探針雜交或免疫化學(xué)染色。但是細(xì)胞固定過程中,固定劑選擇不當(dāng)或者固定程序不合理可能導(dǎo)致GFP熒光強(qiáng)度顯著下降甚至熒光消失,從而不能觀察到GFP的分布、定位及相關(guān)的顯微結(jié)構(gòu)變化[1]。因此,探索不同細(xì)胞固定劑對(duì)GFP發(fā)光特性的影響,對(duì)指導(dǎo)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究具有一定的實(shí)際意義。

      1 實(shí)驗(yàn)

      1.1 細(xì)胞

      HepG2細(xì)胞(ATCC HB-8065TM)購于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院。HepG2細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。一般2~3 d傳代1次。

      1.2 細(xì)胞固定劑

      95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸、丙酮、Carnoy固定液(無水乙醇60 mL+氯仿30 mL+5%冰醋酸10 mL)、4%多聚甲醛(pH值7.4)。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

      1.3 GFP在細(xì)胞中的表達(dá)

      貼壁培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞經(jīng)0.02%EDTA+0.25%胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液,鋪于96孔板上,每孔200 μL,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 d后,用表達(dá)GFP的腺病毒Ad-Pshuttle-CMV-GFP感染,感染復(fù)數(shù)(MOI)為30,48 h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況,當(dāng)細(xì)胞GFP陽性率達(dá)到80%以上時(shí),用于實(shí)驗(yàn)。以未經(jīng)腺病毒感染的細(xì)胞作為對(duì)照。

      1.4 細(xì)胞固定

      將發(fā)光細(xì)胞的培養(yǎng)液吸去,并用PBS洗滌2次,然后加入待試固定劑200 μL,按室溫、4℃分別固定5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min,固定后將固定液吸出,然后用 PBS洗滌3次。倒置顯微鏡(Leica DMILHC)觀察固定后發(fā)光情況并拍照。

      1.5 酶標(biāo)儀測(cè)發(fā)光值

      經(jīng)不同固定劑固定的96孔板上細(xì)胞用熒光/化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀(TECAN F200)測(cè)發(fā)光值(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)535 nm)。對(duì)比固定前后發(fā)光值,按下式計(jì)算GFP熒光保存百分率(F):

      2 結(jié)果與討論

      2.1 熒光顯微鏡觀察固定劑對(duì)細(xì)胞GFP發(fā)光的影響

      HepG2細(xì)胞經(jīng)腺病毒Ad-Pshuttle-CMV-GFP感染,48 h后80%以上細(xì)胞表達(dá)GFP。在感染復(fù)數(shù)為30時(shí),細(xì)胞未見明顯病變。表達(dá)GFP的細(xì)胞用不同固定劑處理后,在顯微鏡下觀察GFP發(fā)光情況,結(jié)果見圖1。

      圖1 不同固定劑對(duì)細(xì)胞GFP發(fā)光的影響(室溫5 min)

      由圖1可以看出,在室溫下,Carnoy固定液、甲醇、5%冰醋酸固定5 min后,細(xì)胞GFP熒光基本消失,95%乙醇固定導(dǎo)致GFP強(qiáng)度顯著降低,而丙酮和4%多聚甲醛固定30 min后仍然可觀察到足夠強(qiáng)的熒光。

      2.2 酶標(biāo)儀檢測(cè)固定劑對(duì)細(xì)胞GFP發(fā)光的影響

      細(xì)胞用不同固定劑進(jìn)行固定,用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞發(fā)光值,結(jié)果見圖2。

      圖2 室溫(a)和4℃(b)固定后細(xì)胞GFP熒光保存百分率

      由圖2可以看出,無論在室溫還是4℃進(jìn)行固定,Carnoy固定液、95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸處理5 min就使得GFP發(fā)光值降低到25%及以下。而4%多聚甲醛和丙酮處理5 min對(duì)GFP發(fā)光無顯著影響;但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),GFP發(fā)光值逐漸降低;當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到30 min時(shí),4%多聚甲醛固定的細(xì)胞和丙酮4℃固定的細(xì)胞仍可保存大約40%的發(fā)光值。

      2.3 討論

      細(xì)胞和組織固定劑種類繁多,應(yīng)根據(jù)不同的組織、細(xì)胞類型及不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇。甲醇、乙醇、丙酮和多聚甲醛是生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的固定劑,冰醋酸和Carnoy固定液用于一些特定的細(xì)胞和組織切片。盡管GFP廣泛用于生物醫(yī)學(xué)的研究,但是對(duì)于組織細(xì)胞固定過程中GFP發(fā)光特性變化的研究報(bào)道很少,實(shí)驗(yàn)人員只能從相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道中收集零星的信息來作為指導(dǎo)。但遺憾的是,大多數(shù)文獻(xiàn)對(duì)細(xì)胞固定方法的描述非常簡(jiǎn)單,使經(jīng)驗(yàn)不豐富的實(shí)驗(yàn)人員難以準(zhǔn)確把握。從已有的文獻(xiàn)報(bào)道來看,表達(dá)GFP的細(xì)胞的固定大多數(shù)采用多聚甲醛,能有效地保持GFP的發(fā)光特性,這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。但是,在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),為了保持GFP的發(fā)光特性,配制多聚甲醛時(shí)必須將其pH值保持在中性,否則會(huì)導(dǎo)致GFP熒光消失。

      本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:丙酮是保持GFP熒光特性的另一可選的細(xì)胞固定劑。在4℃用丙酮固定30 min后,細(xì)胞仍可保持足夠強(qiáng)的熒光。為了保證良好的固定效果,丙酮固定最好在低溫下進(jìn)行。由于丙酮和多聚甲醛固定細(xì)胞機(jī)制不同,因此可為不同目的的實(shí)驗(yàn)研究提供選擇。

      有文獻(xiàn)報(bào)道甲醇固定可保持細(xì)胞內(nèi)GFP的發(fā)光特性[2],但一般認(rèn)為甲醇可能導(dǎo)致GFP發(fā)光強(qiáng)度的減弱[3]。李榮芳等[4]研究表明,甲醇固定會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在進(jìn)行免疫組織化學(xué)過程中GFP熒光消失。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甲醇和乙醇在室溫或4℃時(shí)固定細(xì)胞均會(huì)導(dǎo)致GFP熒光的迅速消失,在較低的溫度下(如-20℃)用甲醇或者乙醇固定細(xì)胞可部分保留GFP的熒光特性,國(guó)外也有文獻(xiàn)報(bào)道將甲醇、乙醇單獨(dú)或者與丙酮、甲醛混合作為細(xì)胞固定劑,但除非特定的實(shí)驗(yàn)需要,建議采用多聚甲醛或丙酮固定細(xì)胞以保持GFP熒光特性。

      3 結(jié)論

      采用6種細(xì)胞固定劑分別在室溫和4℃條件下對(duì)表達(dá)GFP的HepG2細(xì)胞進(jìn)行固定,并對(duì)其發(fā)光特性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論是在室溫還是在4℃條件下,95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸、Carnoy固定液固定細(xì)胞后綠色熒光迅速消失,而丙酮和4%多聚甲醛固定細(xì)胞后仍可保持足夠強(qiáng)的綠色熒光,但保留的熒光強(qiáng)度隨固定劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)和作用溫度的升高而降低。因此,對(duì)表達(dá)GFP細(xì)胞進(jìn)行固定時(shí),宜選擇丙酮和4%多聚甲醇作為固定劑,并降低作用溫度和縮短作用時(shí)間,有利于保持細(xì)胞的綠色熒光。

      [1] Mans Ehrenberg,羅文新,夏寧邵(譯).綠色熒光蛋白——發(fā)現(xiàn)、表達(dá)和發(fā)展[J].生物物理學(xué)報(bào),2008,24(6):422-429.

      [2] Girotti M,Banting G. TGN38-green fluorescent protein hybrid proteins expressed in stably transfected eukaryotic cells provide a tool for the real-time,invivostudy of membrane traffic pathways and suggest a possible role for ratTGN38[J].Journal of Cell Science,1996,109(12):2915-2926.

      [3] Carraway Kermit L,Carraway Coralie A Carothers. Cytoskeleton: Signalling and Cell Regulation: A Practical Approach[M].Oxford:Oxford University Press,2000:114.

      [4] 李榮芳,袁慧,劉定干.甲醇固定導(dǎo)致綠色熒光蛋白的熒光消失[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,2007,29(2): 303-304.

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