羅 浪,楊毅梅

帶絳蟲在動(dòng)物分類學(xué)上屬于絳蟲綱、圓葉目、帶科、帶屬〔1〕。傳統(tǒng)的分類認(rèn)為人體帶絳蟲有豬帶絳蟲和牛帶絳蟲兩種。豬帶絳蟲以豬作為中間宿主,牛帶絳蟲以牛作為中間宿主。但是自上世紀(jì)70年代以來,在我國(guó)臺(tái)灣和東南亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種新的帶絳蟲,其外形與牛帶絳蟲近似,但是因?yàn)槿顺陨幕蛭粗笫斓呢i內(nèi)臟被感染。經(jīng)過近20年來的研究,這種絳蟲被命名為亞洲帶絳蟲(Taenia asiatica)〔2〕。

云南大理是多民族聚集地區(qū),尤以白族為首,當(dāng)?shù)匕鬃寰用裱匾u著古老的風(fēng)俗習(xí)慣,喜吃“生皮”、燒烤,生食豬、牛及野生動(dòng)物的習(xí)慣造成了帶絳蟲病的廣泛流行〔3〕。因此對(duì)該地區(qū)帶絳蟲進(jìn)行鑒定,對(duì)制定當(dāng)?shù)啬酥辽贁?shù)民族地區(qū)帶絳蟲病的防治策略具有重要的實(shí)際意義。本研究以線粒體DNA細(xì)胞色素b(mtDNA-Cytb)基因序列作為分子標(biāo)記,對(duì)云南大理白族帶絳蟲標(biāo)本進(jìn)行分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 帶絳蟲的采集 在對(duì)云南大理白族地區(qū)的帶絳蟲流行病學(xué)調(diào)查過程中,對(duì)糞檢有蟲卵或排節(jié)片史者,采用檳榔、南瓜子驅(qū)蟲,用生理鹽水沖洗干凈,經(jīng)壓片后,置70%酒精中固定保存。貴州省都勻亞洲帶絳蟲由貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng),保存在70%酒精溶液。牛帶絳蟲采自云南省大理洱源,75%酒精保存。

1.1.2 主要試劑 SDS(中山大學(xué)達(dá)暉生物技術(shù)有限公司)、Tris平衡酚(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、dNTPs(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),引物P1、P2(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),TaqDNA聚合酶(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),瓊脂糖(Agarose),(中山大學(xué)達(dá)暉生物技術(shù)有限公司),分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000 DNA Marker)(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)

1.2 方法

1.2.1 帶絳蟲基因組DNA提取 采用酚氯仿法提取絳蟲基因組 DNA〔4〕。

1.2.2 PCR擴(kuò)增mtDNA-Cytb序列部分片段 使用 mtDNA-Cytb 引物〔5〕:

正向引物P1:5′-TTATGAGAT TGTCAAAA GATTCTT-3′

反向引物 P2:5′-TATAGATGTCAAAACAGTAGCAGCCC-3′

由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系及條件:10×buffer(MgCl2 15mmol/L)5μL,dNTP(10 mmol/L)1μL,TaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.3μL,引物(100 mmol/L)各1μL,模板 DNA(200 ng/μL)3μL,無菌雙蒸水補(bǔ)足25μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán);72℃再延伸5 min,4℃保存。取6μL PCR產(chǎn)物與 2μL 6×加樣緩沖液混勻,于1.5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶5μ g/mL)電泳后,在凝膠成像儀上觀察結(jié)果,并照相記錄。

1.2.3 mtDNA-Cytb序列部分片段的克隆和測(cè)定

mtDNA-Cytb序列部分片段的克隆和測(cè)定在天跟生物工程(北京)有限公司進(jìn)行。

1.2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖 帶絳蟲標(biāo)本mtDNA-Cytb序列部分片段測(cè)序結(jié)果用DNAMAN(v5.2.2)軟件處理后進(jìn)行同源性分析 ,并計(jì)算遺傳距離和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳根據(jù)電泳圖預(yù)測(cè),擴(kuò)增的目的片段大小約為250 bp左右,與文獻(xiàn)〔5〕一致。見圖1。

圖1 mtDNA-Cytb序列部分區(qū)段PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis profile of partial segments of mtDNACytb PCR products with 1.5%agarose gel

2.2 帶絳蟲mtDNA-Cytb序列特征

2.2.1 GC含量 云南大理白族帶絳蟲標(biāo)本(B1-B6)mtDNA-Cytb序列部分片段GC含量分別為33.33%、32.86%、35.24%、34.76%、33.81%和32.86%,6株白族帶絳蟲標(biāo)本mtDNA-Cytb序列部分片段A、C、G和T含量見圖2。

2.2.2 帶絳蟲標(biāo)本mtDNA-Cytb序列部分區(qū)段概況 使用引物P1/P2對(duì)大理白族帶絳蟲標(biāo)本mtDNA-Cytb序列部分區(qū)段擴(kuò)增 ,根據(jù)電泳圖預(yù)測(cè)擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度均為 250 bp左右。序列測(cè)定結(jié)果表明,云南大理白族帶絳蟲標(biāo)本(B1-B6)擴(kuò)增片段長(zhǎng)分別為 254 bp、252 bp、262 bp、252 bp、223 bp 和260 bp。

2.3 遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖 使用DNAMAN軟件分析云南大理白族帶絳蟲mtDNA-Cytb序列部分片段,除本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的序列外,還使用了GenBank中的其他序列,其登記編號(hào)分別為AB066580(亞洲帶絳蟲中國(guó)臺(tái)灣)、AB066571(豬帶絳蟲中國(guó)云南)和AB066581(牛帶絳蟲 中國(guó)烏魯木齊)上述3種序列以及測(cè)出的6個(gè)帶絳蟲標(biāo)本序列,計(jì)算遺傳距離(見表1)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。大理白族帶絳蟲(B1、B2、B6)標(biāo)本與臺(tái)灣亞洲帶絳蟲標(biāo)本mtDNA-Cytb序列同源性為100%,大理白族帶絳蟲(B5)標(biāo)本與臺(tái)灣亞洲帶絳蟲標(biāo)本mtDNA-Cytb序列同源性為99%,大理白族帶絳蟲(B3、B4)與中國(guó)云南豬帶絳蟲標(biāo)本mtDNA-Cytb序列同源性為99%。系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果共同顯示:大理白族帶絳蟲(B1、B2、B5、B6)株與臺(tái)灣亞洲帶絳蟲標(biāo)本株首先并為一支,然后與烏魯木齊牛帶絳蟲株相聚(Ⅰ);大理白族帶絳蟲(B3、B4)株與云南豬帶絳蟲標(biāo)本株并成一支(Ⅱ);最后Ⅰ支和Ⅱ支相聚,形成姊妹群關(guān)系。見圖3。

表1 帶絳蟲的氨基酸遺傳距離比較Table 1 Comparison of genetic distances of aminoacids from Taeniacestodes

圖2 大理白族帶絳蟲標(biāo)本mtDNA-Cytb序列部分片段4種核苷酸含量Fig.2 Each content of A,C,G and T in the partial segments of mtDNA-Cytb sequences in Bai population(Dali)sample of Taenia cestodes

圖3 根據(jù)帶絳蟲mtDNA-Cytb序列部分片段數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 phylogenetic tree based on partial segments of mtDNACytb sequences dataof Taenia cestodes(ML Method).

3 討 論

自上世紀(jì)90年代以來,對(duì)于帶絳蟲分類的研究,國(guó)內(nèi)外學(xué)者除了形態(tài)學(xué)外,對(duì)該蟲的研究逐漸轉(zhuǎn)向了從分子生物學(xué)水平來探討其恰當(dāng)?shù)姆诸惖匚弧１疚睦梅肿由飳W(xué)方法對(duì)云南大理白族地區(qū)帶絳蟲蟲株進(jìn)行分類鑒定,選擇mtDNA-Cytb序列作為其分子遺傳標(biāo)記。mtDNA作為胞核外遺傳物質(zhì)具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母性遺傳、無組織特異性等特點(diǎn),是研究寄生蟲分子分類、群體遺傳、系統(tǒng)進(jìn)化的一種很好的分子標(biāo)記〔6-7〕。已經(jīng)證實(shí),Cytb基因序列在解決親緣關(guān)系很近的階元的系統(tǒng)關(guān)系方面非常有用,被認(rèn)為是解決系統(tǒng)發(fā)育問題最可信的mtDNA標(biāo)記之一〔8〕。mtDNA-Cytb基因進(jìn)化速度適中,適合于研究由種內(nèi)到種間甚至于科間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系〔9〕。當(dāng)前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已將mtDNA-Cytb基因應(yīng)用法醫(yī)學(xué)、哺乳動(dòng)物,鳥類、昆蟲、寄生蟲,細(xì)菌等〔10-12〕的分類鑒定研究。

日本學(xué)者〔13〕以COX1和Cob為靶標(biāo),用切除描述胸腺嘧啶基礎(chǔ)序列方法,結(jié)果是特征性胸腺嘧啶基礎(chǔ)峰的圖譜顯示了四個(gè)不同的類型,亞洲帶絳蟲、牛帶絳蟲和兩種基因型豬帶絳蟲。Jeon HK.等〔14〕對(duì)亞洲帶絳蟲作了線粒體基因序列測(cè)定分析,發(fā)現(xiàn)亞洲帶絳蟲與牛帶絳蟲間細(xì)胞色素C氧化酶I(COX1)和Cob(細(xì)胞色素 b)序列的差異分別為4.6%和4.1%,提出亞洲帶絳蟲是牛帶絳蟲的亞種。張晨昊〔15〕等通過采用mtDNA-Cytb序列作為分子遺傳標(biāo)記對(duì)采自云南西部三地帶絳蟲進(jìn)行生物多態(tài)性研究,結(jié)論顯示大理和怒江帶絳蟲屬于亞洲帶絳蟲,云南楚雄帶絳蟲屬于牛帶絳蟲。mtDNACytb序列分析可以用于帶絳蟲生物多態(tài)性研究。

本研究使用DNAMAN軟件分析云南大理白族帶絳蟲mtDNA-Cytb序列部分片段,并結(jié)合GenBank中已知豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲mtDNA-Cytb序列,成功的構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示:大理白族帶絳蟲(B1、B2、B5、B6)株與臺(tái)灣亞洲帶絳蟲標(biāo)本株首先并為一支,然后與烏魯木齊牛帶絳蟲株相聚(Ⅰ);大理白族帶絳蟲(B3、B4)株與云南豬帶絳蟲標(biāo)本株并成一支(Ⅱ);最后Ⅰ支和Ⅱ支相聚,形成姊妹群關(guān)系。結(jié)果表明:大理白族帶絳蟲(B1、B2、B5、B6)株與臺(tái)灣亞洲帶絳蟲之間的關(guān)系最為接近,應(yīng)是同一個(gè)種。大理白族帶絳蟲(B3、B4)株與云南豬帶絳蟲標(biāo)本關(guān)系最為接近,應(yīng)是同一個(gè)種。該結(jié)果說明在帶絳蟲生物多態(tài)性研究中,尤其是牛帶絳蟲與亞洲帶絳蟲分類學(xué)研究中,mtDNA-Cytb序列可以作為種間、種下分類的分子遺傳標(biāo)記。

〔1〕潘衛(wèi)慶,湯林華.分子寄生蟲學(xué)〔M〕.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2004:370.

〔2〕Eom KS.What is Asian Taenia〔J〕.Parasitol Int,2006,55(Suppl):137-141.

〔3〕楊毅梅,李振,石武祥,等.云南大理洱海環(huán)湖帶絳蟲流行病學(xué)調(diào)查〔J〕.中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2007,2(2):109-114.

〔4〕J.薩姆布魯克EF,弗里奇T,曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南〔M〕.2版.北京:科學(xué)出版社,1999(6):464-467.

〔5〕Hiroshi Yamasaki,Minoru Nakao,Yasuhito Sako,et al.DNA differential diagnosis of human taeniid cestodes by base ex cision sequence scanning Thymine-Base reader analysis with mitochondrial genes〔J〕.Clin.Microbiol,2002,40(10):3818-3821.

〔6〕Boore JL,Animal.mitochondrial genomes〔J〕.Nucleic Acids Research,1999,27(8):1767-1780.

〔7〕Feagin JE.Mitochondrial genome diversity in parasites〔J〕.International Journal for Parasitology,2000,30(4):371-390.

〔8〕Zardoya R,Meyer A.Phylogenefic.performance mitochondrial proteineoding genes in resolving relationship among Venebrutes〔J〕.Mol Biol Evol,1996,13(7):933-942.

〔9〕Kouch T D,Thomas W K A,Meyer S V,et al.Dy-namics of mitochondrial DNA evolution in animal:Application and sequencing with conserved primers〔J〕.Proc Acad Sci USA,1989,86(6):1906-2001.

〔10〕劉超,劉宏,李紅霞,等.細(xì)胞色素b基因序列測(cè)定進(jìn)行種屬鑒定應(yīng)用研究〔J〕.刑事技術(shù),2002,4:11-13.

〔11〕耿榮慶.山羊線粒體DNA 細(xì)胞色素b基因序列分析〔J〕.草食家畜,2006,2:32-34.

〔12〕朱振華,葉輝,張智英.基于mtDNA Cytb的六種果實(shí)蠅的分子鑒定〔J〕.昆蟲學(xué)報(bào),2005,48(3):386-390.

〔13〕Yamasaki H,Nakao M,Sako Y,et al.DNA differential diagnosis of human taeniid cestodes by base excision sequence scanning thymine-base reader analysis with mitochondrial genes〔J〕.J Clin Microbiol,2002,40(10):3818-3821.

〔14〕Jeon HK,Kim K H,Eom KS.Complete sequence of the mitochondrial genome of Taenia saginata:comparison with T.solium and T.asiatica 〔J〕.Parasitol Int,2007,56(3):243.

〔15〕張晨昊,楊毅梅.云南西部三地帶絳蟲生物多態(tài)性分子遺傳學(xué)標(biāo)記的研究〔J〕.中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2009,4(4):283-286.