蘇來金,馬麗萍,徐仰麗,徐 靜,周德慶

諾如病毒(Noroviruses,NVs)是引發(fā)病毒性急性腸胃炎的主要病原體之一,該病毒在離體條件下存活力很強(qiáng),主要通過被污染的食物、水等多種途徑進(jìn)行傳播〔1〕。近年來,由于水環(huán)境污染的加劇,許多水產(chǎn)品遭到了NVs的污染,特別是濾食性雙殼貝類體內(nèi)富集的NVs是周圍水環(huán)境中的幾十甚至上千倍〔2〕,致使世界許多地區(qū)均爆發(fā)了因生食含有NVs的雙殼貝類而引發(fā)的大規(guī)模腸胃炎疫情〔3-4〕,給人類健康造成了巨大威脅。因此,水產(chǎn)品中NVs的污染狀況調(diào)查是進(jìn)行食品安全預(yù)警、防控食源性NVs疫情暴發(fā)的重要途徑。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)腹瀉病人糞便中諾如病毒分離株研究的報(bào)道較多〔5-7〕,證明在每一種NVs基因型中存在廣泛的多樣性,而對(duì)于雙殼貝類中NVs含量、種類、基因型別等研究較少〔8〕,國(guó)內(nèi)貝類中NVs污染狀況和基因型別的調(diào)查研究尚未見報(bào)道。鑒于此,本研究對(duì)2007年9月至2008年8月在山東半島沿海8個(gè)地區(qū)采集的186份貝類樣品進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè),并對(duì)NVs陽性分離株進(jìn)行了鑒定分析,旨在了解山東半島地區(qū)貝類中NVs污染情況和毒株類型,補(bǔ)充我國(guó)水產(chǎn)品中NVs污染調(diào)查數(shù)據(jù),為食源性NVs防治和分子流行病學(xué)調(diào)查積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2007年9月至2008年8月采集山東半島的萊州、招遠(yuǎn)、煙臺(tái)、威海石島、乳山、青島等8個(gè)地區(qū)的長(zhǎng)牡蠣(Ostrea crassostrea)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、櫛孔扇貝(Chlamys f arreri)、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)、縊蟶(Sinonovacula constricta)等貝類共186份樣品,取內(nèi)臟置-80℃保存,作為待檢樣品備用。

1.1.2 主要試劑與儀器 配制溶液:蘇氨酸(Thr)緩沖液(0.1mol/L Thr,0.3mol/LNaCl,pH7.5);聚乙二醇(PEG)6000(24%PEG6000,0.6mol/L NaCl);PEG8000(16%PEG8000,0.525mol/L NaCl);PBS緩沖液(137mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,10mmol/L Na2HPO4,2mmol/L KH2PO4,pH7.4);所有試劑配制用水均為焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過無 RNase的二次水。購置試劑:IPTG、X-gal、PGEM-T 載體、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、RNase抑制劑等為均為Promega公司產(chǎn)品;One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit(TaKaRa);高純 RNA提取試劑盒(Roche);膠回收試劑盒(Omega);小量質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN)。主要儀器:3K15型高速冷凍離心機(jī)(Sigma,美國(guó)),SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠),BioPhotomete生物分光光度計(jì)(Eppendorf,德國(guó))公司產(chǎn)品,PTC-200 PCR擴(kuò)增儀(MJ,美國(guó)),LightCycler2.0熒光定量 PCR儀(Roche,瑞士),凝膠成像系統(tǒng)(Vilber Lourmat,法國(guó))。

1.1.3 引物 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔9-10〕本研究用于檢測(cè)NVs的引物及探針,見表1。

表1 用于NVs檢測(cè)的引物與探針Table 1 The primers and probes for detecting NVs

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 貝類樣品中病毒粒子的富集與RNA提取主要步驟:取25g貝類樣品,加入175mL蘇氨酸緩沖液勻漿3min,37℃孵育30min;4℃5 000×g離心20min,取上清;向沉淀中再次加入175mL蘇氨酸緩沖液重懸沉淀,4℃5 000×g離心20min;合并兩次上清液加入等體積 PEG6000溶液,冰上沉淀4h;4℃6700×g離心30min,棄上清;15mL PBS緩沖液重懸沉淀,加入等體積的氯仿,渦旋1min;4℃2000×g離心30min,取上清;上清液加入等體積PEG8000,冰上沉淀 2h;4℃14000×g離心 15min,棄上清;沉淀用200μL PBS緩沖液溶解,按照高純RNA提取試劑盒(Roche)說明書提取病毒RNA。

1.2.2 常規(guī) RT-PCR檢測(cè) RT反應(yīng)體系為20μL,其 中包含 2μL 5 ×AMV Buffer,4μL 10 mmol/L dNTP Mix,1μL 的 20μ mol/L 通用引物,40U RNA酶抑制劑,5 U AMV反轉(zhuǎn)錄酶以及3μLRNA模板。反應(yīng)條件為42℃,90min,反應(yīng)結(jié)束后直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。檢測(cè)GGI型NVs的PCR反應(yīng)體系為 50μL,其中包含 5μL 10 ×Buffer,4μL的 2.5 mmol/L dNTP Mix,10 μ mol/L 引物 COGI-F、COG-I-R各1μL,2.5 U TaqDNA 聚合酶以及2μL cDNA。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,52℃退火 30s,72℃延伸30s,共 40個(gè)循環(huán);72℃終延伸7min。檢測(cè)GGII型NVs的PCR反應(yīng)體系為 50μL,其中包含 5μL 10 ×Buffer,4μL 2.5 mmol/L dNTP Mix,10 μ mol/L JV13I、JV12Y 各1μL,2.5 U TaqDNA 聚合酶以及 2μL cDNA。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性60s,37℃退火90s,74℃延伸60s,共40個(gè)循環(huán);74℃終延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠在1%TAE緩沖液中,100V電泳30min,EB染色,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

1.2.3 熒光定量RT-PCR檢測(cè) 熒光定量RTPCR反應(yīng)體積為20μL,按照試劑盒說明書的體系配置反應(yīng)液,上下游引物0.2μ mol/L,模板 RNA 1μL,混勻后加入 Roche專用石英毛細(xì)管中,在Roche定量 PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:42℃5min反轉(zhuǎn)錄;95℃5s,56℃30s共45個(gè)循環(huán);40℃,10s冷卻結(jié)束反應(yīng)。通過常規(guī)RT-PCR目的產(chǎn)物純化后體外轉(zhuǎn)錄的cRNA,經(jīng)生物分光光度計(jì)測(cè)定濃度、計(jì)算拷貝數(shù)后梯度稀釋,作為熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)病毒RNA進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.4 克隆測(cè)序 陽性PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化后,插入載體pGEM18-T中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取重組子,搖菌后提取質(zhì)粒,由上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 序列分析比較 測(cè)序獲得的序列應(yīng)用BLAST軟件在GenBank尋找相近序列,利用DNAStar軟件進(jìn)行序列的多重比對(duì)和分析;應(yīng)用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。用于系統(tǒng)發(fā)生分析的NVs參考株來自于GenBank數(shù)據(jù)庫,GGI-1～GGI-6參考株登陸號(hào):M87661、L07418、U04469、AB042808、AF414406、AB081723;GGII-1 ～ GGII-3參考株為 U07611、AY134748、U22498;其中GGII-4 型參考株為:X866557、AF145896、AY587985、AY502023、Ab240190;GII-5～GII-8參考株:AF414423、AF397156、AF414409、AB039780;我國(guó)報(bào)道的參考株:EU794706、EU718209、DQ369797、EU703648。

2 結(jié)果與分析

2.1 NVs檢測(cè)結(jié)果 采集的186份樣品常規(guī)RTPCR檢測(cè),用GI型引物檢測(cè)無目的片段檢出,用GII型引物檢測(cè)有5份擴(kuò)增出目的片段,部分 RTPCR檢測(cè)結(jié)果見圖1,熒光定量 RT-PCR對(duì)GGII檢測(cè)陽性樣品RNA進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)情況及定量結(jié)果見表2。

圖1 部分貝類樣品NVs的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The NVs test result of some shellfish samples

表2 貝類樣品中NVs檢測(cè)情況Table 2 The result of NVs detection in shellfish samples

2.2 陽性株序列分析與遺傳進(jìn)化樹 檢測(cè)出的5株NVs陽性毒株分別命名:Norovirus oyster/GII/QingDao,Norovirus clam/GII/WeiHai,Norovirus scallop/GII/RiZhao,Norovirus razorclam/GII/LaiZhou,Norovirus ark clam/GII/YanTai序列已上傳至GenBank中,登錄號(hào)見表2。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆與測(cè)序,陽性株序列與參考毒株比較繪制遺傳進(jìn)化樹(圖2)。

2.3 陽性毒株型別 陽性片段序列在GenBank中搜索比對(duì),與近年來我國(guó)不同地區(qū)報(bào)道陽性株的同源 性 達(dá) 96%以 上(EU794706、EU718209、DQ369797、EU703648),與日本,英國(guó) ,美國(guó)等地報(bào)道的GGII-4亞型遺傳距離較近(AB240190、X86557、AY502023),同源性90%以上,可以初步確定為從貝類中分離到的此5株NVs均屬于GII基因組型的GGII-4亞型。

3 討 論

根據(jù)NVs基因組的RdRp和衣殼蛋白核苷酸序列差異,可將NVs分為5個(gè)遺傳組(Genogroup),其中遺傳組I(Genogroup I,GGI)和遺傳組II(Genogroup II,GGII)以及暫定的遺傳組IV(Genogroup IV,GGIV)感染人類,遺傳組III(Genogroup III,GGIII)和遺傳組V(GenogroupV,GGV)分別感染牛和鼠,遺傳組GI和GII當(dāng)前又分別區(qū)分為14和17個(gè)基因亞型〔11-13〕,重組NVs的出現(xiàn)使基因分型變得更為復(fù)雜,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)23株NV的RdRp和衣殼蛋白基因分屬于不同基因型〔14〕。這些基因型出現(xiàn)給NVs的檢測(cè)帶來了巨大困難。盡管NVs分類復(fù)雜,但在引起胃腸炎暴發(fā)的NVs中,GII-4型 NVs一直處于優(yōu)勢(shì)地位〔15〕。自1992年以來,我國(guó)不同地區(qū)報(bào)道的NVs引發(fā)的嬰幼兒腹瀉研究中GGII-4型也是主要病原〔16〕。

圖2 NVs聚合酶區(qū)部分核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree construct based on partial sequences of of NVs RNA polymerase region

NVs的流行地區(qū)廣泛,全年發(fā)病,但冬季較多見,Mounts〔17〕、Burkhardt 等 人〔18〕的研 究表明 ,NVs的感染主要集中在冬季。近年來,許多國(guó)家暴發(fā)的由于生食牡蠣等雙殼貝類而引發(fā)的NVs疫情也主要集中在秋冬季節(jié)〔19-21〕,本研究中檢出的5份陽性毒株,主要是冬季的貝類樣品。分析原因NVs可能同其他呼吸道病毒一樣,在冬季依靠干燥的空氣傳播,糞-口傳播是主要途徑,而病人腹瀉嘔吐物造成了食物和水的污染,牡蠣等貝類通過受污染的水域在體內(nèi)富集了大量NVs,加上冬春季節(jié)也是牡蠣等貝類收獲季節(jié),消費(fèi)者生食牡蠣數(shù)量增加,因此冬季貝類中NVs檢出最高,因食牡蠣引發(fā)大規(guī)模NVs傳播的案例最多。

本研究從分子水平上初步揭示了山東半島地區(qū)貝類中NVs的污染狀況和基因型別,冬季為高發(fā)季節(jié),由于樣品數(shù)量、采集地區(qū)的限制,尚不能全面的反映我國(guó)水產(chǎn)品中NVs的污染狀況,開展全國(guó)范圍水產(chǎn)品NVs污染狀況調(diào)查,對(duì)于了解水產(chǎn)品污染狀況,保障水產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易、疾病傳染預(yù)警等有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

〔1〕Koopmans M,Duizer E.Foodborne viruses:an emerging problem 〔J〕.Int J Food Microbiol,2004,90:23-41.

〔2〕Shieh Y,Monroe SS,Fankhauser RL,et al.Detection of Norwalk-like virus in shellfish implicated in illness〔J〕.J Infect Dis,2000,181(suppl 2):360-366.

〔3〕Boxman ILA,Tilburg JJHC,te Loeke NAJM,et al.Detection of noroviruses in shellfish in the Netherlands〔J〕.Int Food Microbiol,2006,108:391-396.

〔4〕de Bruin E,Duizer E,Vennema H,et al.Diagnosis of norovirus outbreaks by commercial ELISA or RT-PCR〔J〕.J Virol Methods,2006,137:259-264.

〔5〕Fankhauser RL,Monroe SS,Noel JS,et al.Epidemiologic and molecular trends of"Norwalk-like viruses"associated with outbreaks of gastroenteritis in the United States〔J〕.J Infect Dis,2002,186:1-7.

〔6〕Kageyama T,Shinohara M,Uchida K,et al.Coexistence of multiple genotypes,including newly identified genotypes,in outbreaks of gastroenteritis due to norovirus in Japan〔J〕.J Clin Microbio1,2004,42(7):2988-2995.

〔7〕陳軍林,王 滔,高建民,等.福州地區(qū)腹瀉患者諾瓦克樣病毒感染的分子流行病學(xué)特點(diǎn)〔J〕.中國(guó)人獸共患病雜志,2003,19(2):83-85.

〔8〕Nishida T,Kimura H,Saitoh M,et al.Detection,quantitation,and phy logenetic analysis of noroviruses in japanese oy sters〔J〕.Appl Environ Microbiol,2003,69(10):5782-5786.

〔9〕Vennema H,de Bruin E,Koopmans M.Rational optimization of generic primers used for Norwalk-like virus detection by reverse transcriptase polymerase chain reaction〔J〕.J Clin Virol,2002,25(2):233-235.

〔10〕Kageyama T,Kojima S,Shinohara M,et al.Broadly reactive and hig hly sensitive assay for No rwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR〔J〕.J Clin Microbiol.2003,41:1548-1557.

〔11〕Koopmans MG,Bonsdorrf CH,Vinje J,et al.Foodborne enteric viruses〔J〕.FEMS Microbiol Rev,2002,26:187-205.

〔12〕Ando T,Noel JS,Fankhauser RL.Genetic classification of"Norwalk-like Viruses."〔J〕.JInfectDis,2000,181:S336-S348.

〔13〕Karst SM,Wobus CE,Lay M,et al.ST AT1-dependent innate immunity to a N orwalk-like virus〔J〕.Science,2003,299(5612):1575-1578.

〔14〕Bull RA,Hansman GS,Clancy LE,et al.Norovirus recombination in ORF1/ORF2 overlap 〔J〕.Emerg Infect Dis,2005,11(7):1079-1085.

〔15〕Zheng DP,Ando T,Fankhauser RL,et al.Norovirus classificatlon and proposed strain nomenclature〔J〕.Virology,2006,346(2):312-323.

〔16〕謝華萍,方肇寅,王光,等.長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院1998-2001年嬰幼兒杯狀病毒腹瀉流行病學(xué)研究〔J〕.病毒學(xué)報(bào),2002,18(4):332-336.

〔17〕Mounts AW,Ando M,Koopmans JS,et al.Cold weather seasonality of gastroenteritis associated with Norwalklike viruses〔J〕.J Infect Dis,2000,181(Suppl 2):S284-287.

〔18〕Burkhardt W,Calci KR.Selective Accumulation May Account for Shellfish-A ssociated Viral Illness〔J〕.Appl Environ Microbiol,2000,66(4):1375-1378.

〔19〕Inouye S,Yamashita K,Yamadera S.Surveillance of viral gastroenteritis in Japan:pediatric cases and outbreak incidents〔J〕.J Infect Dis,2000,181:270-274.

〔20〕Le Guyader FS,Bon F,DeM edici D,et al.Detection of multiple noroviruses associated with an international gastroenteritis outbreak linked to oyster consumption 〔J〕.J Clin Microbiol,2006,44:3878-3882.

〔21〕Okada M,Ogawa T,Yoshizumi H.Genetic variation of the norovirus GII-4 genotype associated with a large number of outbreaks in Chiba prefecture Japan〔J〕.Arch Virol,2007,152(12):2249-2252.