胡 瓊,劉瑞珍

腦缺血再灌注是大多數(shù)缺血性腦血管病的主要生理病理過程,其中細胞凋亡是主要環(huán)節(jié)[1]。caspase-8是介導死亡受體通路和線粒體通路兩條凋亡途徑的關(guān)鍵性酶,活化的 caspase-8能激活兩條凋亡通路下游的caspase,擴大凋亡信號,從而引發(fā)致死性的蛋白分解級聯(lián)反應(yīng)[2]。丁苯酞(dl-3n-butylphthalide,NBP)能夠有效的抑制急性腦缺血性損傷的多個病理環(huán)節(jié),在腦缺血再灌注損傷凋亡中起關(guān)鍵作用[3]。本實驗旨在觀察丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷中caspase-8蛋白表達的研究,探討其對腦缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性 Wistar大鼠180只,體重200 g～250 g,由山西醫(yī)科大學生理教研室動物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 丁苯酞石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司提供,批號:08100111。caspase-8單克隆抗體購自 Santa Cruz公司,二抗及Tunel細胞凋亡檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)由山西醫(yī)科大學生理教研室提供。

1.3 方法

1.3.1 局灶性腦缺血再灌注模型建立 缺血再灌注模型采用改良的Zea Longa大腦中動脈閉塞(MCAO)模型制備[4,5]。

1.3.2 實驗動物分組 實驗動物隨機分為5組:假手術(shù)組(n=36);缺血1 h再灌注組(n=36);NBP治療組(n=36):缺血再灌注1 h后給予腹腔注射NBP 80 mg/kg[6];NBP預防組(n=36):給予NBP 80 mg/kg灌胃,每日1次,1周后行腦缺血再灌注模型的制備;NBP預防治療組(n=36):給予NBP 80 mg/kg每日1次灌胃,1周后行缺血再灌注術(shù)后1 h給予腹腔注射NBP80 mg/kg。假手術(shù)組和缺血1 h再灌注組術(shù)后1 h給予等劑量的0.5%Tween80溶劑。每組又按處死時間點分為 6 h、12 h、24 h 3個亞組,每個亞組12只。

1.3.3 神經(jīng)功能缺失體征評分 缺血1 h再灌注6 h、12 h、24 h后觀察大鼠神經(jīng)功能缺失狀態(tài),用單盲法進行Zas-Longa的5分制法評分[4]。采用大鼠手術(shù)麻醉清醒后神經(jīng)功能缺損1分～3分且無蛛網(wǎng)膜下腔出血的動物進行試驗。0分、4分或死亡剔除,再隨機補充。

1.3.4 標本留取 Western blot檢測的標本留取,各組動物分別于相應(yīng)時間點將大鼠麻醉后直接斷頭取腦,去除正常的一側(cè)大腦及小腦,放于-70℃冰箱中保存。

1.3.5 免疫組織化學染色 將組織石蠟塊切片,脫蠟、抗原修復、滴加 1∶200的 caspsae-8抗體,加二抗,DAB顯色,蘇木素復染。每張片子在400倍顯微鏡下,隨機取左側(cè)大腦半球缺血區(qū)10個視野,計算其陽性細胞的灰度值。

1.3.6 Western blot測定 將收集的組織標本取100 mg放入1.5 mL離心管內(nèi),加蛋白裂解液1 mL(RIPA裂解緩沖液),置溫浴中超聲勻漿,10 000 r/min,離心5 min后取上清加入等體積的2×SDS buffer,煮沸5 min,迅速冰浴,10 000 r/min,離心5 min,取上清用于后面實驗。進行蛋白電泳分析。應(yīng)用QUAN TITYONE(Bio-Rad)軟件進行光密度定量,所得結(jié)果以β-actin為參考。

1.3.7 TUNEL法檢測細胞凋亡 凋亡程度以每個視野中TUNEL陽性細胞數(shù)表示,每張切片隨機取6個～8個視野進行觀察。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件。計量資料均以均數(shù)±標準差(±s)表示,多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,任意兩組之間的比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺失體征表現(xiàn) 腦缺血再灌注24 h后在大鼠靜息狀態(tài)下神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)為左前肢屈曲,肌張力降低,側(cè)推阻力降低;活動減少,自發(fā)向左側(cè)追尾轉(zhuǎn)圈;可伴或不伴有右側(cè)Horner征。假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺失癥狀,缺血再灌注組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀。與缺血再灌注組比較,NBP治療組及NBP預防治療組能明顯改善腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺失癥狀,NBP預防組對缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺失癥狀有所改善且大鼠腦缺血再灌注術(shù)后清醒快,清醒后精神狀態(tài)明顯比缺血再灌注組好。

2.2 病理形態(tài)觀察(HE染色)假手術(shù)組腦組織HE染色,皮質(zhì)和海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰嚴密,神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。缺血再灌注組缺血側(cè)出現(xiàn)范圍較大的梗死灶,甚至在病理切片上幾乎占據(jù)整個大腦半球的梗死灶,梗死灶核心區(qū)域成篩狀改變,組織結(jié)構(gòu)消失;海馬組織結(jié)構(gòu)明顯異常,細胞排列紊亂、數(shù)目減少、皺縮變形。與缺血再灌注組比較,NBP治療組海馬組織細胞排列略呈紊亂,細胞皺縮變形、胞核固縮等表現(xiàn)明顯減輕。NBP預防組與缺血再灌注組病理形態(tài)學改變亦有差別,其凋亡程度較其輕。NBP預防治療組光鏡下與NBP治療后的病理形態(tài)學改變無明顯差異。

2.3 Caspase-8的表達 假手術(shù)組偶見散在caspase-8陽性細胞。與假手術(shù)組比較,缺血再灌注組不同時間點出現(xiàn)大量caspase-8陽性細胞,廣泛分布于皮質(zhì)和海馬組織梗死灶周邊區(qū)域(P＜0.05),主要在神經(jīng)元胞漿中表達,部分核內(nèi)也可見。NBP治療組、預防組及預防治療組的caspase-8陽性細胞數(shù)明顯減少,與缺血再灌注組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。NBP預防治療組與NBP治療組比較,在缺血再灌注后6 h、12 h時caspase-8的表達,治療組少于預防治療組(P＜0.05)。詳見表1。

表1 大鼠腦皮層caspase-8表達的平均灰度值比較(±s)

表1 大鼠腦皮層caspase-8表達的平均灰度值比較(±s)

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術(shù)組 36 177.47±1.67 177.57±1.17 177.49±1.08缺血再灌注組 36 154.71±0.97 150.59±1.181) 146.66±1.102)NBP治療組 36 168.26±1.193) 170.41±1.112)3) 175.87±0.902)3)NBP預防組 36 157.61±0.923)4) 160.29±1.252)3)4) 165.36±1.222)3)4)NBP預防治療組 36 169.25±0.963)5) 172.50±0.842)3)4) 176.19±1.262)3)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與前一時間點比較,2)P＜0.01;與缺血再灌注組比較,3)P＜0.01;與治療組比較,4)P＜0.05

2.4 Western blot測定結(jié)果 正常大鼠及假手術(shù)組中腦組織caspase-8活性片段的蛋白表達量很低。缺血再灌注組caspase-8蛋白的表達量明顯上調(diào)(P＜0.05)。NBP治療組、預防組及預防治療組的蛋白表達明顯低于缺血再灌注組(P＜0.01),NBP預防組的Caspase-8蛋白表達與缺血再灌注組比較,表達量有所減少,但不如治療組下調(diào)明顯(P＜0.05);預防治療組在缺血再灌注24h表達與治療組無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表2 Western印跡缺血再灌注24 h caspase-8表達(±s)

組別 caspase-8/beta正常組 0.668±0.026假手術(shù)組 0.670±0.015缺血再灌注組 1.101±0.0171)NBP治療組 0.730±0.0282)NBP預防組 0.816±0.0232)3)NBP預防治療組 0.736±0.0402)4)與任一組比較,1)P＜0.05;與缺血再灌注組比較,2)P＜0.01;與治療組比較,3)P＜0.05

3 討 論

人的腦組織對缺血以及再灌注均非常敏感,易發(fā)生缺血再灌注損傷。腦組織發(fā)生缺血性改變后,梗死灶中心以細胞死亡為主,而在梗死灶邊緣,細胞的丟失則以凋亡為主。因而,有效地減少細胞過度凋亡可以減輕缺血再灌注對組織器官的損傷。

caspase家族是細胞凋亡過程中重要的蛋白酶。腦缺血后發(fā)生的神經(jīng)元凋亡其信號轉(zhuǎn)導機制十分復雜,目前認為主要有兩條信號轉(zhuǎn)導通路,即死亡受體通路和線粒體通路,而這兩條通路都以caspase-8基因的激活為特征。本實驗結(jié)果證明,大鼠腦缺血再灌注后,各組中caspase-8蛋白質(zhì)的表達水平明顯升高,而且分布及動態(tài)演變規(guī)律與缺血后神經(jīng)元凋亡的變化基本一致,提示此蛋白參與了腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生和發(fā)展。因此對caspase-8蛋白質(zhì)進行早期干預,有可能避免或降低凋亡的發(fā)生,從而減輕缺血性損傷。

NBP是人工合成的消旋體,其左旋體存在于芹菜籽中。現(xiàn)代藥理研究表明,NBP可增加缺血區(qū)腦血流。

本實驗觀察到,caspase-8在缺血再灌注后隨時間的延長,表達持續(xù)增高,隨著再灌注時間的延長,其主要表達在缺血周圍區(qū)域,提示caspase-8可能參與缺血后神經(jīng)元凋亡的病理生理過程。假手術(shù)組可偶見散在caspase-8陽性細胞,可能與手術(shù)創(chuàng)傷刺激有關(guān)。丁苯酞治療組及預防治療組可明顯改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)功能缺失癥狀和腦組織的病理損害,還可以顯著減少各時間點梗死灶周邊缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元caspase-8的表達。丁苯酞預防組與缺血再灌注組比較,同樣能下調(diào)caspase-8蛋白的表達量,但較治療組及預防治療組效果較差,提示 NBP提前預防給藥可以適當減少caspase-8的表達,從而有一定的預防缺血性腦血管病的作用。

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