莫 揚(yáng)，李智山

(襄陽市中心醫(yī)院檢驗科，湖北 襄陽 441021)

急性白血病(acute leukemia，AL)是由于造血細(xì)胞分化阻滯并克隆性增生所致的惡性疾病，免疫分型不僅可以識別白血病細(xì)胞的系列來源以及所處的分化階段，而且可利用某些抗原表達(dá)及亞型判斷疾病預(yù)后?，F(xiàn)今流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)免疫表型分析已成為AL診斷和分型的重要工具，采用 CD45/側(cè)向角散射(SSC)雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門方法可清楚地識別白血病細(xì)胞克隆，排除了正常細(xì)胞對免疫分型的影響，使得白血病免疫分型結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。流式細(xì)胞術(shù)在白血病免疫分型中用到許多抗體，包括早期非特異性抗體和各系列相關(guān)抗體，而各系列相關(guān)抗體的敏感性及特異性文獻(xiàn)報道不盡一致，尤其是各亞型多種抗原陽性表達(dá)患者中陽性細(xì)胞的比例報道極少，現(xiàn)將襄陽市中心醫(yī)院研究結(jié)果報告如下。

材料和方法

一、臨床資料

選取2007年1月至2010年12月在襄陽市中心醫(yī)院初診及外院送檢的AL患者共89例，男48例，女41例，平均年齡36.65(3～66)歲。依據(jù)法國(French)、美國(American)、英國(British)三國協(xié)作組(FAB)制定的分型標(biāo)準(zhǔn)分為:急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)29例[急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)26例，急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)3例]，急性髓細(xì)胞白血病(AML)60例(M12例、M234例、M38例、M46例、M510例)。

二、方法

1.單克隆抗體選擇原則 選用單克隆抗體熒光標(biāo)記分別為異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)、別藻青蛋白(APC)。依據(jù)敏感性與特異性兼顧的原則，確定B-ALL選用CD19-APC(高敏感性)和cCD79a-PE(高特異性);確定T-ALL選用CD7-FITC(高敏感性)和 cCD3-FITC(高特異性);確定 AML選用CD13-PE(高敏感性)和髓過氧化物酶(cMPO)-FITC(高特異性)。其他抗體還有:CD117-PE、CD33-PE、CD11b-APC、CD14-APC、CD64-FITC、CD56-FITC、CD8-FITC、CD4-APC、CD10-FITC、CD34-PE、CD38-APC、CD3-FITC、CD45-PerCP、主要組織相容性抗原(HLA-DR)-PE及同型對照IgG1-FITC/IgG1-PE。以上熒光標(biāo)記抗體購自美國Becton Dickinson公司。

2.標(biāo)本采集和流式細(xì)胞術(shù)分析 取肝素鈉抗凝骨髓或外周血2 mL，標(biāo)本中原始幼稚細(xì)胞占全部有核細(xì)胞比例≥20%。采用四色直接標(biāo)記，每管取細(xì)胞數(shù)1×106/mL。胞膜抗原檢測加CD45-PerCP及每種分型單克隆抗體各20 μL，室溫暗處孵育15 min，加入溶血劑溶血10 min，加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后上機(jī)分析;胞內(nèi)抗原檢測首先加CD45-PerCP后暗處孵育15 min，加溶血劑溶血10 min，PBS洗滌后加透膜劑暗處孵育10 min，加入胞內(nèi)抗體室溫暗處孵育20 min，加PBS洗滌后上機(jī)分析。每測定管獲取100000個細(xì)胞。測定結(jié)果采用cellquestpro軟件分析:首先以CD45/SSC設(shè)門，圈定CD45弱陽性和SSC較小區(qū)域細(xì)胞進(jìn)行分析。然后以其他抗體的二維散點(diǎn)圖結(jié)合細(xì)胞散點(diǎn)分布特點(diǎn)確定白血病細(xì)胞在每種抗體的陽性率。胞內(nèi)抗體以陽性細(xì)胞≥10%為陽性，胞膜抗體以陽性細(xì)胞≥20%為陽性[1]。本研究采用 FACSCalibur(美國 Becton Dickinson公司)流式細(xì)胞儀，測定前以標(biāo)準(zhǔn)校正熒光微球校正儀器;溶血劑及透膜劑均為美國 Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、AL抗原表達(dá)特征

B-ALL主要表達(dá)抗原為:cCD79a、CD19、HLA-DR、CD34、CD38、CD13、CD10、CD33;T-ALL主要表達(dá)抗原為:cCD3、CD38、CD7、CD34、HLADR、CD4、CD33、CD8;AML 主要表達(dá)抗原為:cMPO、CD38、CD13、CD33、CD117、HLA-DR，CD14僅在 M4和 M5b表達(dá);M3主要表達(dá)抗原為:cMPO、CD117、CD38、CD13、CD33，低表達(dá) HLADR、CD34。交叉抗原表達(dá):B-ALL主要伴有CD13、CD33表達(dá)，T-ALL主要伴有 CD33表達(dá)，AML主要伴有 CD7、CD56表達(dá)，但 M3除外，見表1。

二、各亞型陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例

對各亞型(M1由于病例少未納入分析)抗原陽性表達(dá)患者中陽性細(xì)胞的比例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其平均陽性細(xì)胞比例有區(qū)別。胞漿抗體cMPO、cCD79a、cCD3作為系列特異性標(biāo)志在AML(M5除外)、B-ALL、T-ALL中陽性細(xì)胞均有較高的比例，在 50% ～70% 之間;M2中 CD13、CD33、CD34、HLA-DR、CD38陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例均＞60%，說明這些抗原表達(dá)強(qiáng)度高;M3以CD13、CD33陽性細(xì)胞比例高，雖有部分患者表達(dá)CD34、HLA-DR，但其陽性細(xì)胞比例較低，分別僅有31.5%及27.2%，說明抗原為弱表達(dá);M4中以CD38、HLA-DR、CD33陽性細(xì)胞比例高，而 CD13僅為42.6%，與M2有較大區(qū)別;M5中以CD13、CD33、CD34、HLA-DR 抗原強(qiáng)表達(dá)，CD13、CD33表達(dá)強(qiáng)度無明顯差異，但cMPO陽性細(xì)胞比例較低，約在 35%左右;B-ALL中以 CD19、CD10、CD34、CD38強(qiáng)表達(dá)，屬于交叉抗原表達(dá)的CD13明顯強(qiáng)于CD33的表達(dá)強(qiáng)度;T-ALL中CD7、CD34陽性細(xì)胞比例在80% ～90%，3例患者中有2例出現(xiàn)CD33表達(dá)且陽性細(xì)胞比例高達(dá)80%，見表2。

表1 FAB各亞型免疫表型特征

表2 各亞型抗原陽性表達(dá)患者中陽性細(xì)胞的比例(，%)

表2 各亞型抗原陽性表達(dá)患者中陽性細(xì)胞的比例(，%)

注:與M2同指標(biāo)比較，*P＜0.05、＊＊P＜0.01;與CD13比較，#P＜0.01;—為陰性表達(dá)或病例數(shù)少未納入統(tǒng)計

抗原M2 M3 M4 M5 B-ALL T-ALL CD7 52.7 ±30.6 — 35.22 ±10.2 — —92.0 ±0.5 CD117 34.8 ±14.7 45.2 ±12.6 20.51 ±4.4 23.3 ±5.9 — —CD38 67.9 ±26.5 48.4 ±20.7 75.9 ±3.8 52.1 ±26.5 72.3 ±19.1 55.9 ±17.9 CD13 73.9 ±21.3 61.6 ±20.3 42.6 ±19.7＊＊ 72.8 ±24.0 71.6 ±27.1 —CD34 75.7 ±21.4 31.5 ±10.2 67.9 ±1.5 70.4 ±7.1 73.7 ±21.5 91.1 ±7.5 HLA-DR 66.7 ±24.6 27.2 ±2.1 79.3 ±8.5 60.3 ±23.6 89.4 ±10.0 59.5 ±52.0 CD33 66.8 ±24.2 70.3 ±25.2 80.7 ±16.3* 87.8 ±21.2 45.7 ±22.6# 83.5 ±16.9#cMPO 54.4 ±11.7 63.0 ±16.2 70.4 ±9.5 34.5 ±10.1* — —CD11b 25.9 ±13.7 32.7 ±9.1 35.8 ±7.6 34.6 ±10.3 24.5 ±1.7 —CD64 28.3 ±14.8 40.5 ±10.2 41.2 ±15.8 78.1 ±23.9＊＊ — —CD14 — — 34.4 ±3.1 57.3 ±45.4 — —CD10 — — — — 66.7 ±15.4 —CD19 — — — — 67.4 ±23.2 —cCD79a — — — — 69.8 ±22.1 —cCD3— —53.6 ±18.9

三、系列分化抗原總表達(dá)率及陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例

將AML各亞型合并統(tǒng)計可知，AML中系列分化抗原總表達(dá)率及陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例為 CD13(96.7%，68.6% ± 22.7%)、CD33(95.0%，72.6% ± 23.5%)、cMPO(90.0%，57.5% ± 26.9%)、CD117(73.3%，33.7% ±14.4%);B-ALL中系列分化抗原總表達(dá)率及陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例為 cCD79a(96.2%，69.8% ± 22.1%)、CD19(96.2%，67.4% ±23.2%)、CD10(53.8%，66.7% ± 15.4%);TALL中系列分化抗原總表達(dá)率及陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例為 cCD3(100.0%，53.6% ±18.9%)、CD7(66.7%，92.0% ±0.5%)。

討 論

從本研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，胞漿抗原cMPO、cCD79a、cCD3作為系列特異性標(biāo)志在AML、BALL、T-ALL中總的表達(dá)率高達(dá)90%以上，且陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例較高，在50% ～70%之間(M5稍低)，是確定系列必須的抗原。cMPO在AML各亞型中表達(dá)率均高，但其陽性表達(dá)細(xì)胞比例在M5僅有34.5%，明顯低于其他AML亞型，在區(qū)別M2與M5時可供參考。本研究3例TALL中有1例僅以cCD3陽性表達(dá)，依據(jù)2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)AL積分系統(tǒng)[2]評分標(biāo)準(zhǔn)，T系積分＞2分而診斷。

AML中 CD13、CD33表達(dá)率均 ＞95%，是AML的標(biāo)志性抗體，但其陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例有差別，M2中 CD13的陽性細(xì)胞比例(73.9%)明顯高于M4(42.6%)，而其CD33 的陽性細(xì)胞比例(66.8%)低于 M4(80.7%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明二者的陽性細(xì)胞比例在鑒別M2與M4時有參考價值。國內(nèi)、外關(guān)于 AML中CD117 表達(dá)率的報道為 58.2% ～90.38%[3-5]，本研究為73.3%，但其陽性細(xì)胞比例只在20% ～45%之間，與李慶等[6]結(jié)果相符，顯示CD117在AML中為弱表達(dá)抗原，但未見在ALL中表達(dá)，可作為AML的特異性抗原。CD14只在M4/M5b中表達(dá)，對單核系統(tǒng)的特異性很高，其陽性細(xì)胞比例分別為 34.4%及 57.3%，與寧鉑濤等[7]的研究結(jié)果一致。CD64在M5中顯示出較高的表達(dá)率和陽性細(xì)胞比例(60.0%，78.1% ± 23.9%)，從而有助于區(qū)別 M2(11.8%，28.3% ±14.8%)，國外文獻(xiàn)報道CD64對于M4、M5敏感性和特異性均很高[8];M3 中 CD117、CD13、CD33 均 為100.0%表達(dá)，陽性細(xì)胞比例分別為 45.2%、61.6% 和70.3%，王亞哲等[9]的文章報道使用PharMingen公司抗體，CD117在M3中陽性細(xì)胞比例為71.97%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究結(jié)果，可能與抗體種類不同有關(guān)。部分M3患者表達(dá)CD34、HLADR，但其陽性細(xì)胞比例僅有31.5%和27.2%，為弱表達(dá)抗原。

B-ALL中CD19及CD10表達(dá)率和陽性細(xì)胞比例均高，是確定 B系的主要抗原;CD13和CD33是B系交叉表達(dá)的主要抗原，表達(dá)率相似，但CD13的陽性細(xì)胞比例(71.6%)明顯強(qiáng)于CD33(45.7%)。3例T-ALL中有2例表達(dá)CD7，并且陽性細(xì)胞比例高達(dá)92.0%，說明CD7是TALL表達(dá)重要抗原，而在AML中陽性細(xì)胞比例約為30% ～50%，提示當(dāng)CD7陽性細(xì)胞比例明顯升高時更應(yīng)該考慮T-ALL的可能性。這2例患者同時伴有CD33的強(qiáng)表達(dá)，陽性細(xì)胞比例83.5%，而CD13為陰性表達(dá)，與B-ALL有很大的不同。陳麗娟等[10]報道136例T-ALL中31例帶有髓系標(biāo)記，CD13表達(dá)高于CD33，與本研究結(jié)果不同，可能與我們的病例數(shù)太少有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。胞漿cCD3是T-ALL診斷的特異性和敏感性均較高的指標(biāo)，一般在AML和B-ALL中無表達(dá)，本組2例T-ALLCD3陰性而胞漿cCD3檢測呈陽性，說明cCD3比CD3敏感性更高。因此，對于伴有其他T系抗原標(biāo)志而CD3陰性患者，應(yīng)常規(guī)檢測cCD3。

CD34為干/祖細(xì)胞相關(guān)抗原，CD34陽性白血病提示白血病細(xì)胞是早期的造血細(xì)胞惡化所致，在AML中的陽性率達(dá)40% ～60%，和預(yù)后有關(guān)[11]。本研究顯示AML中CD34總的表達(dá)率為55.0% ，ALL中 CD34總表達(dá)率為65.5%，均與文獻(xiàn)報道相符合[12]。除 M3外，CD34陽性細(xì)胞比例均顯示出較高的水平。另一造血系統(tǒng)早期抗原HLA-DR在M3表達(dá)率及陽性細(xì)胞水平均較低，在其他類型AL中均為高表達(dá)。

綜上所述，AL各亞型間抗原表達(dá)率及陽性細(xì)胞的比例存在差異，可作為流式細(xì)胞術(shù)免疫分型診斷的依據(jù)。

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