楊明偉, 葉 非

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,哈爾濱 150030)

隨著農(nóng)藥工業(yè)的發(fā)展,大規(guī)模使用化學(xué)農(nóng)藥所帶來的環(huán)境問題日益嚴(yán)重,研究者們相繼對除草劑、殺蟲劑、殺菌劑、殺線蟲劑的微生物降解進行了深入細致的研究,近幾十年工作發(fā)現(xiàn)微生物對土壤和水環(huán)境的農(nóng)藥降解起主要作用,已分離出一批能降解或轉(zhuǎn)化某些農(nóng)藥的微生物類群,并探討了微生物降解農(nóng)藥的主要作用方式及降解機制,以及各類化學(xué)農(nóng)藥微生物降解的途徑[1-3]。本文綜述了近年來農(nóng)藥生物降解的研究進展,提出存在的問題和發(fā)展趨勢。

1 降解農(nóng)藥的微生物類別

已報道的降解農(nóng)藥的微生物有細菌、真菌、放線菌、藻類等,大多數(shù)來自土壤微生物類群。細菌由于其生化上的多種適用能力以及容易誘發(fā)突變菌株從而占了主要的位置,其中假單胞菌屬是最活躍的菌株,對多種農(nóng)藥有分解作用。圖1列舉了主要的降解農(nóng)藥的微生物類別[4]。

圖1 降解農(nóng)藥的微生物類別

2 微生物降解農(nóng)藥的途徑與機理

目前,對于微生物降解農(nóng)藥的研究主要集中于細菌。細菌降解農(nóng)藥的本質(zhì)是酶促反應(yīng),即化合物通過一定的方式進入細菌體內(nèi),然后在各種酶作用下,經(jīng)過一系列的生理生化反應(yīng),最終將農(nóng)藥完全降解或分解成分子量較小的無毒或毒性較小化合物的過程。如假單胞菌ADP菌株以莠去津為唯一碳源,有3種酶參與了降解莠去津的前幾步反應(yīng),首先是AtzA酶催化莠去津水解脫氯的反應(yīng),得到無毒的羥基莠去津,該酶是莠去津生物降解的關(guān)鍵酶;其次是AtzB酶催化羥基莠去津脫氯氨基反應(yīng),產(chǎn)生N-異丙基氰尿酰胺;第3步是AtzC酶催化N-異丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和異丙胺;最終莠去津被降解為CO2和NH3[5]。由于降解酶往往比產(chǎn)生該類酶的微生物菌體更能忍受異常環(huán)境條件,酶的降解效率遠高于微生物本身,所以利用降解酶可以作為凈化農(nóng)藥污染的有效手段。但是,降解酶在土壤中容易受非生物變性、土壤吸附等作用而失活,難以長時間保持降解活性,并且酶在土壤中的移動性差等因素,限制了降解酶在實際中的應(yīng)用。試驗已經(jīng)證明,編碼合成這些酶系的基因多數(shù)在質(zhì)粒上,如2,4-D的生物降解,即由質(zhì)粒攜帶的基因所控制,通過質(zhì)粒上的基因與染色體上的基因的共同作用,在微生物體內(nèi)把農(nóng)藥降解[6]。

目前對于各種殺蟲劑的微生物降解途徑已比較清楚,表1列舉了幾種主要的降解途徑[7]。

表1 微生物降解農(nóng)藥的主要途徑

3 影響微生物降解農(nóng)藥的因素

3.1 微生物自身的影響

微生物的種類、代謝活性、適應(yīng)性等都直接影響到對農(nóng)藥的降解與轉(zhuǎn)化。已經(jīng)證明,不同的微生物種類或同一種類的不同菌株對同一有機底物或有毒金屬的反應(yīng)都不同。Kumar等[15]研究了Bacillus circulans-I,B.circulans-II和Staphylococcussp.3種不同細菌對硫丹的降解,研究表明：3種細菌純系培養(yǎng) 14d后,對α-硫丹的降解率分別為93.3%±0.15%,93.4%±0.15%和 89.95%,對 β-硫丹的降解率分別為75.96%±0.05%,76.73%±0.05%和82.9%±0.05%。

微生物具有較強的適應(yīng)和被馴化的能力,通過一定的適應(yīng)過程,新的化合物能誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生相應(yīng)的酶系來降解,或通過基因突變等建立新的酶系來降解。微生物降解本身的功能特性和變化也是最重要的因素。陳歡林[16]指出真菌的代謝方式十分特殊,真菌細胞通過分泌胞外酶將潛在的食物分解,然后再吸收進入細胞,具有很強的分解能力。其中,白腐真菌對很多有毒污染物具有降解轉(zhuǎn)化作用,為生物降解開拓了一條新的途徑。白腐真菌的特異耐毒性,使其對毒性大的有機氯化物(如滴滴涕、林丹、氯丹等)也具有廣譜降解能力。Huang等[17]研究表明Boletusedulis,Gomphidiusviscidus,Laccaria bicolor和Leccinumscabrum等4種白腐真菌對滴滴涕具有降解能力。

微生物因其自身的生活習(xí)性不同,對不同農(nóng)藥的降解有著完全不同的結(jié)果,這也是研究人員普遍關(guān)心的問題,隨著人們對微生物了解的深入,農(nóng)藥降解的研究也會取得長足發(fā)展。

3.2 農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的影響

農(nóng)藥化合物的分子量、空間結(jié)構(gòu)、取代基的種類及數(shù)量等都影響到微生物對其降解的難易程度。不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥,生物降解性由易到難依次為脂肪酸類、有機磷酸鹽類、長鏈苯氧基脂肪酸類、短鏈苯氧基脂肪酸類、單基取代苯氧基脂肪酸類、三基取代苯氧基脂肪酸類、二硝基苯類、氯代烴類[18]。一般情況下,高分子化合物比低分子量化合物難降解,聚合物、復(fù)合物更能抗生物降解[19];空間結(jié)構(gòu)簡單的比結(jié)構(gòu)復(fù)雜的容易降解[20];易溶于水的農(nóng)藥比難溶于水的農(nóng)藥易降解[21]。陳亞麗等[22]在試驗中發(fā)現(xiàn),凡是苯環(huán)上有-OH或-NH2的化合物都比較容易被假單胞菌WBC-3所降解,這與苯環(huán)的降解通常先羥化再開環(huán)的原理一致。Potter等[23]在小規(guī)模堆肥條件下研究了多環(huán)芳烴的降解后指出,2-4環(huán)的芳烴比5-6環(huán)的芳烴容易降解。虞云龍[24]的研究表明,降解菌對擬除蟲菊酯和一硫代膦酸酯殺蟲劑的降解速率的差異主要是由它們的疏水性參數(shù)(lgKow)引起的。但是,并非lgKow越小降解速率越大,氯代酚等化合物的微生物降解速率先隨著疏水性的降低而增大,疏水性進一步降低降解速率又減小,說明有機化合物對細胞膜的穿透要求合適的疏水性。

微生物只能降解特定結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥,所以農(nóng)藥結(jié)構(gòu)決定降解該農(nóng)藥的微生物種類,只有對污染環(huán)境農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)充分了解,才能有效地對其進行生物降解。

3.3 環(huán)境因素的影響

環(huán)境因素包括溫度、酸堿度、營養(yǎng)、氧、底物濃度、表面活性劑等。Sarfraz等[25]研究了假單胞菌Pseudomonasspinosa,P.aeruginosa和Burkholderiacepacia對硫丹的降解,證明了溫度和pH對微生物降解硫丹的影響,指出上述三菌株降解硫丹的最佳溫度為30℃,pH為8.0。Athanasios等[26]研究了敵草隆的微生物降解,指出其好氧降解為60%,降解產(chǎn)物為DCA,厭氧降解則超過95%,降解產(chǎn)物為DCPU。Rhodes[27]研究了不同土壤對2,4-二氯苯酚降解的影響,發(fā)現(xiàn)微生物或其產(chǎn)生的酶系降解農(nóng)藥都需要適宜的溫度、pH及底物濃度。

Hundt等[28]調(diào)查了芳香基化合物在土壤中和堆肥中被細菌Ralstonia和Pickettii降解及礦化情況,在土壤水分適宜的條件下,非離子型表面活性劑吐溫80可增強微生物對芳香基化合物的利用率。Kastner等[29]認(rèn)為,在堆肥與被多環(huán)芳烴污染的土壤混合的情況下,堆肥中有機基質(zhì)含量對于農(nóng)藥降解的作用要大于堆肥中生物的含量對于農(nóng)藥降解的作用;營養(yǎng)對于以共代謝作用降解農(nóng)藥的微生物更加重要,因為微生物在以共代謝的方式降解農(nóng)藥時,并不產(chǎn)生能量,需其他的碳源和能源物質(zhì)補充能量。

農(nóng)藥的生物降解是一個復(fù)雜的過程,影響因素很多。近年來,人們越來越多地關(guān)注到環(huán)境對農(nóng)藥的生物降解的影響,取得了很多成果,在今后的研究中,尤其在農(nóng)藥生物降解實際應(yīng)用中,環(huán)境因素將是人們必須考慮的因素。

4 農(nóng)藥微生物降解的新技術(shù)和新方法

4.1 固定化微生物技術(shù)在農(nóng)藥降解中的應(yīng)用

自20世紀(jì)70年代后期以來,固定化微生物的研究迅速發(fā)展,其應(yīng)用范圍很廣。其中,應(yīng)用固定化微生物技術(shù)降解污水中的農(nóng)藥,成為一個新的研究領(lǐng)域。Jiyeon等[30]利用海藻酸鈣固定微生物,對蠅毒磷的降解進行試驗,取得了滿意的結(jié)果,其降解能力優(yōu)于未固定化微生物。Quan等[31]用蜂窩狀航空陶瓷包埋固定無色桿菌Achromobactersp.,制成流動床來降解2,4-D,去除率達87.9%～100%。

由于固定化細胞對底物和氧氣擴散有阻礙,使細胞酶活性降低,通過基因工程手段制備高效工程菌是解決該問題的關(guān)鍵。閆艷春等[32]克隆抗性庫蚊酯酶基因并在大腸桿菌中高效表達,用海藻酸鈉包埋固定此工程菌,并處理有機氯農(nóng)藥三氯殺蟲酯和菊酯類農(nóng)藥溴氰菊酯,結(jié)果表明,固定化工程菌能高效降解這兩種農(nóng)藥。

4.2 農(nóng)藥降解酶制劑的研制及應(yīng)用

如果用微生物產(chǎn)生的酶來處理農(nóng)藥殘留而不是直接使用微生物菌株,那么對環(huán)境造成威脅或潛在威脅的風(fēng)險即可降低。研究表明,一些酶比產(chǎn)生這類酶的微生物菌體更能忍受變異的環(huán)境條件,如對硫磷水解酶可耐受高達10%的鹽濃度和50℃的溫度,而產(chǎn)生這種酶的假單胞菌在這種條件下卻不能生長[33]。固化酶對環(huán)境條件有較寬的忍受范圍,可用于農(nóng)藥及類似結(jié)構(gòu)的環(huán)境污染物的凈化。用降解酶凈化農(nóng)藥具有良好的效果,能否應(yīng)用取決于穩(wěn)定性及固定化技術(shù)的實用性,降解酶的獲得可通過生物技術(shù)對降解農(nóng)藥的基因進行克隆、基因的高效表達來實現(xiàn)。

4.3 降解基因的克隆、表達及基因工程菌的構(gòu)建

分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展為農(nóng)藥降解菌從實驗室走向?qū)嶋H應(yīng)用提供了可能。人們寄希望通過基因工程技術(shù)將農(nóng)藥降解酶基因或降解質(zhì)?？寺〉胶线m的宿主菌中并使其高效表達,構(gòu)建“高效農(nóng)藥降解菌”,為農(nóng)藥的微生物降解開辟一條新途徑。這一領(lǐng)域已成為當(dāng)今環(huán)境生物技術(shù)的研究熱點之一,也是今后工作的重點。Richard等[34]構(gòu)建的帶有有機磷水解酶基因的工程大腸桿菌能夠快速降解有機磷農(nóng)藥。沈標(biāo)等[35]采用三親接合法成功地將帶有 luxAB基因的 Ptr102質(zhì)粒轉(zhuǎn)入甲基1605降解菌DLL-1中,獲得的接合子熒光非常強,而且標(biāo)記質(zhì)粒非常穩(wěn)定。此外,除草劑2,4-D降解質(zhì)粒、莠去津降解酶基因等已成功地克隆表達[36]。

5 存在的問題及展望

目前已相繼分離和鑒定了各種降解農(nóng)藥的微生物菌株(包括細菌、真菌等),但是利用微生物進行生物修復(fù)的實際應(yīng)用卻往往由于其降解效率較低而受到影響。農(nóng)藥微生物降解的問題主要有以下幾方面：(1)單一菌株的純培養(yǎng)問題;(2)環(huán)境條件對微生物降解農(nóng)藥的影響;(3)微生物降解目標(biāo)化合物對降解的影響;(4)微生物與被降解物接觸的難易程度;(5)微生物的適應(yīng)性問題。因此,農(nóng)藥降解菌從實驗室到實際應(yīng)用還有一段路要走。

微生物降解農(nóng)藥的研究方向包括：高效農(nóng)藥降解工程菌的開發(fā)、混合菌的培養(yǎng)、降解菌的固定化、白腐真菌降解農(nóng)藥的研究和農(nóng)藥生物降解的模型定量化研究。近年來,伴隨著基因工程和分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展,科研工作者開始把重心轉(zhuǎn)移到高效工程菌的構(gòu)建,采用基因重組技術(shù),將表達高效降解農(nóng)藥的酶的基因構(gòu)建到載體中,經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得工程菌,以期提高起降解作用的特定蛋白質(zhì)或酶的表達水平,從而提高降解效率,既能克服一些酶在環(huán)境中不能穩(wěn)定存在的問題,又保持了酶的高活性。隨著基因工程進一步發(fā)展,微生物在農(nóng)藥降解方面的潛力會得到更充分的體現(xiàn)。

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