羅格列酮和二甲雙胍治療對胰島素抵抗KKAy糖尿病小鼠肝及橫紋肌組織PTEN蛋白表達的影響

曾靜波,李玉秀,孫 琦,王 姮

三磷酸肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路為胰島素主要信號傳導通路,發(fā)生胰島素抵抗時,PI3K-Akt通路的活性降低[1,2]。PTEN(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10,染色體10刪除的強力同系物的物磷酸酶)為一種脂質(zhì)磷酸酶,是一個很有效的PI3K-Akt通路的負性調(diào)節(jié)因子[3-5]。我們已有的研究結(jié)果表明胰島素抵抗糖尿病 KKAy小鼠肝及橫紋肌組織PTEN蛋白的表達增加[6]。Lo等[7]研究了肥胖Zucker大鼠比目魚肌PTEN的表達,發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗時PTEN的表達明顯增加,但其機制不詳。羅格列酮及二甲雙胍均可改善胰島素敏感性[8,9]。羅格列酮可以快速上調(diào)細胞中PT EN mRNA水平和蛋白水平的表達[10]。目前尚無羅格列酮及二甲雙胍在組織水平對PTEN表達影響的報道。本研究通過觀察胰島素抵抗KKAy糖尿病小鼠羅格列酮和二甲雙胍治療后PI3K-Akt通路活性及 PTEN表達的變化,探討降糖治療以及改善胰島素敏感性對肝及橫紋肌組織PTEN表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及標本采集 實驗動物均為雄性小鼠,購自中國醫(yī)學科學院實驗動物所,飼養(yǎng)在室溫22～25℃、濕度約50%的動物房中,每晝夜給予12 h光照和12 h黑暗。分為對照C57BL/6 J小鼠組和KKAy小鼠組,C57BL/6 J小鼠普通飼料喂養(yǎng)至16～18周齡,處死取材;KKAy小鼠普通飼料喂養(yǎng)至12周齡,隨后高脂飼料(1.5%膽固醇和5%動物油)喂養(yǎng)4周,測定尾靜脈血糖(羅氏愛康全血糖儀),連續(xù)兩次隨機血糖大于16.7 mmol/L診斷為糖尿病。KKAy糖尿病小鼠隨機分為3組,一組不經(jīng)任何處理,一組給予羅格列酮(4 mg/片,葛蘭素史克公司贈送)12.5 mg/kg bid灌胃,一組給予二甲雙胍(粉劑,施貴寶公司贈送)3 g/kg bid灌胃,治療4周。實驗動物均在處死前空腹12 h,每組動物分別隨機分為未用胰島素處理組及胰島素處理組,未用胰島素處理組小鼠尾靜脈血測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),眼內(nèi)疵靜脈取血,留眥取血清ELISA法測定血胰島素后處死;胰島素處理組胰島素處理前后尾靜脈取血測血糖,腹腔注射胰島素(5 mU/g)后10 min處死小鼠。各組小鼠在處死后即取肝組織、股四頭肌。

1.2 試劑 小鼠胰島素檢測ELISA試劑盒購自Linco公司,PT EN單克隆抗體及 Phospho-Akt(Ser473)多克隆抗體均購自Cell Signaling公司。辣根酶標記的抗IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 組織蛋白提取及定量 50 mg樣本加組織裂解液,肝組織在 Polytron 15 000 r/min冰上勻漿1 min,肌肉組織勻漿 1.5 min,兩種勻漿液分別14 000×g離心 10 min,取上清 -70 ℃保存,并用Bradford法測組織蛋白濃度。

1.4 SDS-PAGE 制備10%的分離膠及5%的濃縮膠,取凍存肝、橫紋肌及脂肪組織上清各20 μ l及蛋白相對分子質(zhì)量標準上樣電泳。采用半干式電轉(zhuǎn)移法,將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,PVDF膜先后與一抗抗體、過氧化物酶標志的二抗及顯色底物孵育后顯色。顯色條帶照相,并用凝膠圖像分析儀(GAS7001B,英國,UVI;成像軟件 UVIPhoto,分析軟件為UVISoft UVIB and Application V97.04)灰度掃描定量分析,每個組織的測定值均為兩次結(jié)果平均值。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件包,實驗數(shù)據(jù)以±s表示,多組比較采用方差分析,組間比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍和羅格列酮對KKAy糖尿病小鼠血糖和胰島素水平的影響 糖尿病組小鼠胰島素和血糖水平顯著高于對照組小鼠,經(jīng)過二甲雙胍和羅格列酮處理后血糖較未處理的KKAy小鼠顯著降低;處理后血清胰島素水平較未處理KKAy小鼠顯著下降,但仍高于正常對照組(表1)。

表1 各組小鼠血糖和胰島素水平

2.2 肝組織胰島素刺激后磷酸化Akt及PT EN蛋白的表達 KKAy糖尿病小鼠肝組織胰島素刺激后磷酸化Akt升高的倍數(shù)較C57BL/6J小鼠顯著降低(P＜0.001);KKAy糖尿病小鼠經(jīng)羅格列酮及二甲雙胍治療后磷酸化Akt升高倍數(shù)與KKAy糖尿病小鼠相比均無明顯變化(P＞0.05;圖1,表2)。KKAy糖尿病小鼠PTEN蛋白較C57BL/6J小鼠顯著升高,約1.24倍(P＜0.001);KKAy糖尿病小鼠經(jīng)羅格列酮及二甲雙胍治療后,PT EN蛋白表達無明顯變化(P＞0.05;圖2,表 2)

2.3 橫紋肌組織胰島素刺激后磷酸化Akt及PTEN蛋白的表達 KKAy糖尿病小鼠橫紋肌組織胰島素刺激后磷酸化Akt升高的倍數(shù)較C57BL/6J小鼠顯著降低(P＜0.001)。KKAy糖尿病小鼠經(jīng)羅格列酮及二甲雙胍治療后橫紋肌組織磷酸化Akt升高倍數(shù)與KKAy糖尿病小鼠相比均無明顯變化(P＞0.05;圖3,表3)。KKAy糖尿病小鼠橫紋肌PTEN蛋白較C57BL/6J小鼠顯著升高(P＜0.001),KKAy糖尿病小鼠經(jīng)羅格列酮及二甲雙胍治療后橫紋肌組織PTEN與KKAy糖尿病小鼠相比均無明顯變化(P＞0.05;圖4,表3)。

圖4 二甲雙胍和羅格列酮處理后KKAy糖尿病小鼠G橫紋肌組織PTEN蛋白水平

表2 各組小鼠肝組織Akt蛋白磷酸化水平及PTEN蛋白的變化情況±s)

表2 各組小鼠肝組織Akt蛋白磷酸化水平及PTEN蛋白的變化情況±s)

注:與C57BL小鼠比較,**P＜0.001

組別 n Akt磷酸化升高倍數(shù)PTEN蛋白/β-actin C57BL小鼠 5 4.67±0.55 6.0±1.2未處理小鼠 6 2.51±0.29** 13.5±0.3**二甲雙胍處理KKAy小鼠6 2.77±0.26** 15.6±1.1**羅格列酮處理KKAy小鼠6 2.56±0.18** 15.0±0.9**

表3 各組小鼠橫紋肌組織Akt蛋白磷酸化水平及PTEN蛋白的變化情況(±s)

表3 各組小鼠橫紋肌組織Akt蛋白磷酸化水平及PTEN蛋白的變化情況(±s)

注:與C57BL小鼠比較,**P＜0.001

組別 n Akt磷酸化升高倍數(shù)PTEN蛋白/β-actin C57BL小鼠 5 4.82±0.22 0.18±0.19未處理小鼠 6 2.31±0.48** 0.98±0.21**二甲雙胍處理KKAy小鼠6 2.55±0.40** 1.13±0.21**羅格列酮處理KKAy小鼠6 2.40±0.31** 1.07±0.18**

3 討 論

KKAy小鼠是目前研究伴隨肥胖及胰島素抵抗的一種較好的2型糖尿病動物模型,本研究中KKAy糖尿病小鼠空腹血糖升高的同時伴隨明顯的高胰島素血癥,因此存在胰島素抵抗。

胰島素刺激可以激活 PI3K-Akt通路,其中Akt Ser473的磷酸化為PI3K激活后Akt的主要磷酸化形式。已有研究表明,發(fā)生胰島素抵抗時PI3K-Akt通路的活性降低[1,2],我們的研究結(jié)果顯示胰島素刺激后肝及脂肪組織Akt Ser473磷酸化升高水平較C57BL小鼠普通飼料喂養(yǎng)組及高脂喂養(yǎng)組均顯著降低,說明此種糖尿病小鼠肝及橫紋肌組織PI3K-Akt通路的活性顯著降低。KKAy糖尿病小鼠經(jīng)羅格列酮及二甲雙胍治療4周后,胰島素敏感性得到了一定的改善,但肝及橫紋肌組織已經(jīng)表達增加的PTEN蛋白水平以及降低的胰島素刺激后Akt Ser 473磷酸化水平均無顯著性變化。Kanoh等[11,12]觀察了Goto-Kakizaki糖尿病大鼠在給予羅格列酮處理10～14 d后脂肪組織及股外側(cè)肌PI3K及Akt活性的變化,結(jié)果顯示,羅格列酮不會引起胰島素刺激后GK大鼠PI3K以及Akt Ser473磷酸化水平的變化,這與我們的結(jié)果是一致的,表明羅格列酮及二甲雙胍可能不會影響胰島素抵抗時的PI3K-Akt通路活性。

細胞培養(yǎng)方面的實驗結(jié)果表明羅格列酮通過激動PPARγ可以快速上調(diào)PTEN mRNA水平和蛋白水平的表達[13,14],同時伴隨PI3K依賴性信號通路的下調(diào)。這與我們的研究結(jié)果不一致。其原因可能在于:(1)KKAy糖尿病小鼠發(fā)生胰島素抵抗后,PT EN已經(jīng)處于過度表達狀態(tài),因此雖然羅格列酮為 PPARγ激動劑,可以上調(diào)PTEN的表達,但是對于已經(jīng)處于過度表達狀態(tài)的PT EN的表達不再有影響;(2)可能存在導致PTEN持續(xù)表達的因素,雖然對KKAy糖尿病小鼠用羅格列酮治療了4周,但是引起PTEN表達的因素可能一直未能去除且持續(xù)存在。

發(fā)生胰島素抵抗的KKAy糖尿病小鼠在應用二甲雙胍治療后,空腹血糖及胰島素均顯著下降,但已經(jīng)表達增加的肝及橫紋肌組織PTEN蛋白水平在治療后無變化,已經(jīng)降低的胰島素刺激后Akt磷酸化水平亦無顯著變化,表明二甲雙胍的降糖機制可能與PTEN無關(guān)。

因此,羅格列酮及二甲雙胍治療后胰島素抵抗KKAy糖尿病小鼠在胰島素抵抗改善的情況下,肝及橫紋肌組織胰島素刺激后P-Akt及PTEN表達無顯著變化,說明兩者降糖途徑可能均為非PI3K-Akt途徑,并且不會影響 PTEN蛋白的表達。PTEN有可能作為改善胰島素抵抗的一個新靶點,從而為研究開發(fā)新的改善胰島素抵抗的藥物提供基礎理論依據(jù)。

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